Morphométrie du poumon :

A - BUT DE L’ANALYSE QUANTITATIVE DU POUMON :

S’il s’agit d’établir une relation solide entre la structure et la fonction d’un poumon, il est évident qu’une simple analyse de sa morphologie, même ultrastructurale, ne peut suffire :

des données quantitatives sont indispensables.

En effet, si l’on s’imagine qu’une molécule d’oxygène doit passer de l’alvéole pulmonaire dans le sang, elle doit franchir une série d’obstacles, de barrières, qui offrent à son passage des résistances d’autant plus grandes que les distances à franchir sont longues.

D’autre part, plus la superficie de la barrière est grande, plus nombreuses sont les molécules à pouvoir franchir la barrière simultanément.

Cette réflexion montre qu’il est possible d’évaluer les capacités fonctionnelles d’un poumon sur les bases morphologiques quantitatives, telles que par exemple les épaisseurs des barrières respectives et la surface totale interne d’échanges gazeux.

C’est sur la base de telles considérations que Weibel publia en 1970- 1971 son modèle de capacité de diffusion pulmonaire morphométrique.

Le modèle s’appuie sur le principe de Fick, qui définit la résistance R d’un conducteur par ses dimensions, c’est-àdire sa section S et sa longueur (ou épaisseur) t selon la formule 1 :

R = K . t/S

La constante K correspond au coefficient de perméation qui dépend des caractéristiques du matériel du conducteur d’une part et du gaz en question d’autre part.

À part les coefficients physiques, tous les paramètres requis (surfaces, volume et épaisseurs) sont mesurables par des procédés morphométriques basés sur la stéréologie.

Grâce à ce modèle, il a été possible de tester des hypothèses diverses concernant les effets de modifications fonctionnelles sur la structure vice-versa (hypoxie, hyperoxie, entraînement physique, résection pulmonaire).

B - MORPHOMÉTRIE ET STÉRÉOLOGIE : DÉFINITIONS

Dans le contexte d’analyses quantitatives en histologie, deux termes sont très souvent employés comme synonymes : la morphométrie et la stéréologie.

La morphométrie, dans son sens le plus large, comprend toutes les formes de mesures servant à établir les dimensions des structures.

Donc, mesurer le volume d’un organe, la longueur d’un être humain ou employer des méthodes stéréologiques sur des coupes histologiques sont tous des procédés morphométriques.

Le terme de stéréologie est d’une signification plus restreinte.

La stéréologie se préoccupe d’analyser et d’établir les lois géométricostatistiques permettant d’obtenir des informations sur les dimensions et la forme des corps dans l’espace à partir de mesures faites sur des plans bidimensionnels.

En clair, l’histologiste ou le microscopiste tente de parvenir, par l’emploi de méthodes stéréologiques, à des connaissances quantitatives spatiales des corps qu’il examine en coupe.

Pour parvenir à l’analyse fonctionnelle du poumon décrite dans la section précédente, l’analyse stéréologique peut se limiter, à trois types de paramètres, soit à l’étude des volumes, des surfaces et des épaisseurs.

Il est clair que dans un contexte différent d’autres paramètres peuvent prévaloir.

C - MÉTHODES STÉRÉOLOGIQUES :

Dans le présent bref aperçu méthodologique, nous nous limitons à une courte introduction des principes de base et à la présentation des trois types de paramètres nécessaires à l’évaluation de la fonction pulmonaire.

1- Principes de base :

Les deux paramètres de base caractérisant une structure sont le volume et la surface. Les deux peuvent aisément être mesurés sur des coupes.

2- Estimation de la densité de volume :

C’est en 1847 déjà, que le géologue français Delesse démontra que la fraction de volume (= densité de volume, VVi) d’une composante i dans un volume déterminé s’obtient directement à partir de la densité de surface AAi qui, elle, correspond à la fraction de la surface totale occupée par la composante i sur la coupe (formule 2).

VVi = Ai/AT =A Ai

Cette fraction de surface peut être obtenue par un comptage de points, une méthode proposée en 1933 par Glagolev.

Ce dernier a démontré qu’il était possible de mesurer la fraction de surface AAi : en superposant sur une coupe un ensemble de points PT et en établissant le quotient entre le nombre de points Pi tombant sur la structure et PT selon la formule 3 :

VVi = i = Pi/PT

Cette méthode, si primitive qu’elle puisse paraître, s’est révélée extrêmement efficace, c’est-à-dire rapide et précise dans une comparaison directe de différentes méthodes permettant d’estimer AA.

3- Estimation de la densité de surface :

L’approche permettant de mesurer la surface d’une structure contenue dans un volume de référence (densité de surface), est un peu plus complexe que pour le paramètre précédent.

Le principe en a été découvert et indépendamment redécouvert plus de dix fois en géologie et en histologie.

La surface d’un corps spatial apparaît sur une coupe comme un tracé qui est d’autant plus long que la surface est grande.

Cette relation directe peut être mise à profit.

Il s’avère que la densité de surface SVi d’un corps est proportionnelle à la longueur des contours du corps sur la coupe (Bi), divisée par l’aire de référence mesurée (A), selon la formule 4 :

SVi = 4 . Bi/∏ . A

Pour obtenir SVi, il suffit donc de mesurer la longueur du tracé Bi dans l’aire de référence A, ce qui est possible par des méthodes différentes allant du simple curvimètre à la tablette à digitaliser.

Les méthodes manuelles couramment employées dans les analyses quantitatives ultrastructurales du poumon mettent à profit le principe de Buffon.

Il est possible de mesurer la longueur d’un tracé (Bi) dans une aire donnée (A) en superposant un système de lignes de longueur déterminée L, et en comptant le nombre d’intersections I des lignes avec le tracé selon la relation (formule 5) :

Bi/A = BAi = ∏/2. I/LT

Si l’on substitue B/A dans la formule 4, l’on obtient (formule 6) :

I/LT

ce qui signifie que la densité de surface SVi, est égale à deux fois le nombre d’intersections I entre le système de lignes et les contours des éléments à mesurer, divisé par la longueur totale LT des lignes du réseau stéréologique superposé.

4- Estimation de l’épaisseur d’une barrière :

Il est évident alors, que les parties minces de la barrière jouent pour la diffusion un rôle plus important que les parties épaisses.

Dans le modèle de Weibel, cela est pris en considération par l’emploi de la moyenne harmonique de l’épaisseur de la barrière sh, et non de la moyenne arithmétique qui, elle, reflète davantage la masse de tissu nécessaire à maintenir l’intégrité de l’appareil d’échanges gazeux.

D - PROBLÈMES MÉTHODOLOGIQUES :

Alors que les principes fondamentaux de la stéréologie sont simples, l’application pratique des méthodes stéréologiques au poumon peut présenter des difficultés ou des pièges qu’il faut connaître.

1- Espace de référence :

Mis à part les paramètres absolus mesurés directement sur la préparation, tels que, par exemple, les épaisseurs des barrières, les méthodes stéréologiques produisent des résultats relatifs, ce qui signifie qu’ils sont exprimés par rapport à un volume unitaire.

Le volume dans lequel on mesure est appelé volume ou espace de référence.

En général, ce dernier ne correspond pas au volume total de l’organe qui est composé de compartiments divers.

Comme seules les dimensions absolues des structures permettent d’évaluer les capacités fonctionnelles d’un organe, il est indispensable de déterminer à chaque fois le volume exact qu’occupe l’espace de référence dans l’organe en question.

Si nous voulons connaître, par exemple, le volume total des capillaires d’un poumon, il faut, pour avoir la résolution nécessaire, mesurer l’espace capillaire sur des micrographies électroniques.

Les blocs utilisés pour cet examen sont prélevés dans le parenchyme pulmonaire, compartiment dont sont exclues les structures qui ne contribuent pas à l’échange gazeux, telles que vaisseaux pulmonaires, voies respiratoires et éléments du tissu conjonctif.

Suivant la grosseur du poumon, il faut donc déterminer la fraction volumétrique du parenchyme dans le poumon en deux temps : par morphométrie au niveau macroscopique et en microscopie optique.

Dans l’exemple ci-dessus, le volume capillaire total du poumon (VC) de l’appareil d’échanges gazeux s’obtient finalement par la multiplication successive du volume pulmonaire total (VL) par la fraction de volume du parenchyme pulmonaire (VVp) et par la fraction de volume des capillaires dans le parenchyme (VVc) (formule 7) :

VC = VL . VVp . VVc

L’analyse morphométrique du poumon requiert donc la création d’une hiérarchie d’espaces de référence, définis successivement à des grossissements croissants afin de permettre la quantification des différents paramètres avec une résolution optimale.

Évidemment, ce procédé est étroitement lié au problème de l’échantillonnage.

2- Échantillonnage :

Les nécessités techniques d’une analyse morphométrique détaillée au niveau ultrastructural réclament un échantillonnage en cascade permettant d’établir les fractions volumétriques respectives des différents espaces de référence.

Un système hiérarchique d’échantillonnage adapté au poumon sera décrit en détail dans la section sur l’application pratique de la morphométrie au poumon.

Rappelons ici cependant, le principe fondamental à observer dans chaque échantillonnage : à tous les niveaux, la sélection des échantillons doit se faire selon les lois du hasard.

Si ce principe n’est pas respecté, les résultats obtenus seront faussés ou biased.

La construction d’un schéma correct d’échantillonnage peut représenter l’un des problèmes les plus complexes à résoudre dans un travail morphométrique.

3- Fixation :

L’analyse quantitative impose que les structures à mesurer soient convenablement préservées par le fixateur.

Dans la plupart des cas, l’on aura le choix entre deux méthodes de fixation : la perfusion par le système vasculaire, ou tout simplement la fixation par immersion.

Pour le poumon, une troisième possibilité s’impose, la fixation par voie intratrachéale, qui permet, après création d’un pneumothorax, une fixation rapide de tout l’organe à une pression déterminée et contrôlée.

Ce mode de fixation préserve très bien les structures tissulaires et capillaires, mais il détruit l’interface naturel existant entre l’air et le sang : il lave donc la paroi alvéolaire de sa couverture de surfactant.

Ce dernier peut être préservé in situ par perfusion vasculaire du fixateur, qui détruit toutefois le contenu vasculaire.

L’information structurale que l’on veut obtenir de l’organe détermine le choix du mode de fixation.

La présentation claire et détaillée de la méthodologie complète dans tout travail morphométrique permet une évaluation des conditions de fixation et des possibles erreurs qui y sont liées.

La connaissance des pH et des osmolarités des fixateurs des médias de rinçage et autres, est importante et permet une éventuelle reproduction ou une discussion des résultats par d’autres investigateurs.

E - MORPHOMÉTRIE DU PARENCHYME PULMONAIRE :

1- Approche pratique :

* Estimation du volume pulmonaire total :

Toute analyse stéréologique complète de la capacité d’échanges gazeux du poumon requiert des connaissances exactes du volume pulmonaire et de ses compartiments respectifs.

Dans les travaux morphométriques récents, la fixation intratrachéale du poumon humain a été exécutée in situ à une pression constante de 25 cm H2O.

Une fois le poumon isolé, la meilleure méthode pour en obtenir le volume est la méthode d’immersion basée sur le principe d’Archimède et proposée par Scherle.

* Analyse morphométrique des compartiments pulmonaires :

S’il est généralement admis que le parenchyme pulmonaire des petites espèces animales est plus ou moins homogène, il n’en va pas de même pour le poumon en entier ou pour les poumons de plus grandes dimensions.

En effet, le poumon présente une structure inhomogène si nous considérons qu’environ 15 à 20 % de son volume total est occupé par des structures relativement larges, telles que les vaisseaux sanguins et l’arbre bronchique qui présentent tous deux une hiérarchie marquée du hile à la périphérie.

De plus, dans les poumons volumineux, une inhomogénéité du parenchyme serait due aux forces de gravité, provoquant un gradient dans les dimensions des alvéoles et des capillaires.

Il s’agit donc d’adapter les espaces de référence, et la procédure d’échantillonnage à cette situation, ce qui implique souvent plusieurs niveaux d’échantillonnage.

Grâce à cette stratégie et à l’homogénéité des spécimens au dernier niveau d’échantillonnage, il suffit d’examiner un nombre très limité de blocs au microscope électronique, ce qui confère à ce procédé une grande efficience.

Pour l’analyse morphométrique ultrastructurale proprement dite, on obtient de chaque bloc une coupe ultrafine techniquement parfaite pour en tirer au hasard entre 8 et 16 micrographies électroniques.

Les images sont projetées sur un écran contenant une grille-test stéréologique servant au comptage des points et des intersections décrit dans la section précédente.

Dimensions du poumon humain :

Les analyses morphométriques de poumons d’enfants et d’adultes exécutées selon les méthodes décrites plus haut ont permis d’obtenir des notions plus détaillées sur les dimensions et particulièrement aussi sur la croissance de l’appareil d’échanges gazeux.

La présentation des résultats se limitera ici aux paramètres importants pour la fonction d’échanges gazeux. Pour de plus amples détails, l’on se référera aux publications originales.

A - VOLUME PULMONAIRE :

Le volume pulmonaire adulte moyen après fixation par voie intratrachéale à une pression de 25 cm H2O est de 4341 mL (SE 285).

Évalué sur toute la période de croissance jusqu’à l’âge adulte, il augmente en moyenne à la puissance 1,05 du poids du corps , valeur qui n’est pas significativement différente de 1.

La part qu’occupe le parenchyme pulmonaire est relativement constante et peut être estimée en moyenne à 85 % du volume pulmonaire total.

Le parenchyme de son côté contient 87 % d’espaces aériens et seulement 13 % de tissu chez l’homme adulte.

Le poumon du nouveau-né en revanche est moins « aéré », il contient près de 28 % de tissu.

Ceci signifie qu’après la naissance (surtout pendant les 6 premiers mois), le volume pulmonaire augmente plus par dilatation que par croissance effective de la masse tissulaire.

Ce processus nécessite un réarrangement du tissu qui se présente sous la forme d’une restructuration des septa du parenchyme (affinement des septa, maturation du système capillaire).

B - CAPILLAIRES PULMONAIRES :

Les capillaires pulmonaires forment un système dense de mailles sur toute la surface interne de l’appareil d’échanges gazeux.

Schématiquement, le système est formé de mailles hexagonales, ce qui signifie qu’en général trois segments capillaires sont interconnectés à un point de jonction.

Le nombre de segments capillaires a été estimé par Weibel (1963) à environ 300 X 109.

Chez l’adulte, le volume capillaire varie entre 125 et 387 mL (moyenne 213 cm3, SE 31) et la surface capillaire de 74 à 189 m2 (moyenne 126 m2, SE 12).

Si l’on met en relation ces quantités, on réalise qu’environ 2 décilitres de sang sont distribués sur une surface de près de 130 m2, ce qui permet de former une couche de sang théorique de 1,6 µm d’épaisseur.

Pendant la croissance pulmonaire, le volume capillaire augmente à la puissance 1,2 du poids des individus, c’est-à-dire significativement plus rapidement que le volume pulmonaire qui augmente en proportion directe au poids du corps.

C - SURFACE ALVÉOLAIRE ET BARRIÈRE AIR-SANG :

La surface alvéolaire du poumon humain varie entre 87 et 184 m2, la moyenne étant de 143 m2.

Dans la plupart des espèces animales examinées jusqu’à présent, la surface capillaire totale ne diffère en général pas plus de 10 à 12 % de la surface alvéolaire.

Alors que chez le rat, le quotient surface capillaire par surface alvéolaire dépasse 1 et varie entre 1,05 et 1,1, il est d’environ 0,88 chez l’homme adulte.

Les micrographies électroniques montrent que l’épaisseur de la barrière air-sang varie très largement d’un endroit à l’autre.

Aux endroits les plus minces, elle mesure à peine 0,3 µm, alors qu’aux endroits les plus épais, elle s’étend sur plusieurs micromètres.

Si la moyenne arithmétique (s) de l’épaisseur de la barrière reflète la masse de tissu contenue dans les septa interalvéolaires, et peut donc être mise en relation avec la fonction mécanique du tissu, la moyenne harmonique (sh) représente, comme nous l’avons vu plus haut, le paramètre adéquat pour l’analyse fonctionnelle de la capacité de diffusion.

Il est intéressant de constater que, pendant le développement pulmonaire postnatal, sh reste pratiquement constant (0,6 µm) jusqu’à l’âge adulte, alors que s est tout d’abord élevé à la naissance (5,6 µm chez un enfant de 1 mois) pour ensuite décroître rapidement et atteindre des valeurs adultes (moyenne de 8 poumons : 2,2 µm) aux environs de 18 mois.

Cette diminution reflète les transformations profondes de la structure du poumon postnatal (alvéolisation et surtout maturation des septa interalvéolaires).

Ces transformations n’influent cependant que peu sur la capacité de diffusion de l’organe, puisque d’une part sh reste constant et que d’autre part, les surfaces d’échanges gazeux croissent en proportion directe au poids du corps.

D - DONNÉES CELLULAIRES :

Des données intéressantes ont été obtenues concernant la composition cellulaire du parenchyme pulmonaire.

Si l’on compare les surfaces couvertes respectivement par les cellules épithéliales et endothéliales, l’on s’aperçoit que ces dernières sont beaucoup plus nombreuses mais moins étendues que les pneumocytes I et présentent donc une surface de moindre complexité que la couverture alvéolaire.

D’autre part, les cellules de type I couvrent 92,5 % (SE 0,6 %) de la surface alvéolaire et les pneumocytes II le reste.

Les cellules interstitielles quant à elles sont de loin les plus nombreuses.

E - CAPACITÉ DE DIFFUSION PULMONAIRE MORPHOMÉTRIQUE :

La valeur moyenne de huit poumons humains s’élève à 2,5 mLO2s-1hPa-1 (2,5 mLO2s-1 mbar-1) (SE 0,27).

Les analyses morphométriques complètes décrites plus haut ont le grand désavantage de détruire l’intégrité du poumon.

Il s’impose de compléter ces études stéréologiques par des techniques de mesures non destructives.

Longtemps, nous nous sommes heurtés aux limites des possibilités techniques.

En attendant, différents modèles basés sur une approche mathématique de la structure du poumon ont permis d’étudier cette différence.

Les modélisations tridimensionnelles purement mathématiques des unités fonctionnelles bronchiques ont été réalisées sur une base fractale pour servir de fondement à une modélisation physiologique pulmonaire.

Cependant, les résultats n’ont pas été totalement convaincants.

Autres techniques de visualisation et de mesures :

Ces dernières années ont vu le développement de techniques de visualisation numérisées.

Ces techniques sont utilisées dans le but d’examiner, de comprendre et de mesurer les détails de l’arrangement de l’organe sans destruction de son arrangement original.

La microscopie confocale permet une visualisation de certains détails tridimensionnels des alvéoles, mais la profondeur focale et les déformations géométriques liées aux indices de réfraction en regard de la taille des acini et de la dimension des poumons réduisent l’intérêt de la méthode.

A - IMAGERIE ACOUSTIQUE :

En plaçant des capteurs sonores en divers points de la cage thoracique, il est possible de réaliser ce qu’il est convenu d’appeler une image acoustique.

Cette technique met en évidence de subtiles modifications régionales des bruits respiratoires ainsi qu’un délai sonore entre les diverses régions pulmonaires.

Elle suggère une modulation locale de la ventilation en fonction de la configuration spatiale du volume et du temps inspiratoire.

Bien que les relations entre les bruits respiratoires et l’anatomie bronchique semblent expliquées, les raisons exactes des différences observées entre diverses parties pulmonaires ne sont pas encore suffisamment comprises.

B - IMAGERIE PAR RAYONS X :

Les techniques utilisant les procédés radiologiques classiques se heurtent aux faibles différences de contraste des structures pulmonaires et de l’air et manquent encore de résolution.

Elles ne permettent que la modélisation des bronches principales jusqu’à la 7e génération au plus.

Seule la microtomographie informatisée permet d’envisager une visualisation tridimensionnelle jusqu’aux extrémités ultimes de la structure pulmonaire et une comparaison directe avec certaines techniques de microscopie.

En permettant une visualisation non seulement du système aérien mais aussi du système vasculaire, la microtomographie semble être en mesure d’apporter des éléments de réponse aux questions en suspens.

La résolution actuelle d’environ 3 µm3 permet une reconstruction fine, mais n’est pas encore suffisante pour autoriser la modélisation du système capillaire.

Des rayons X issus d’un synchrotron devraient sous peu offrir la résolution suffisante.

Il est encore trop tôt pour déterminer si ces nouvelles méthodes auront un impact sur la compréhension de la physiologie pulmonaire mais d’ores et déjà, une visualisation et une mesure tridimensionnelle précise des structures pulmonaires microscopiques permettent de caractériser de façon fine les pathologies observées au niveau alvéolaire.

Les techniques numériques tridimensionnelles permettent bientôt d’aborder des sujets jusqu’alors impénétrables comme l’organisation de l’arborescence, ses conséquences sur l’aérolique fine des voies respiratoires, et la comparaison des différences structurales entre les espèces.

Organisation et arborescence :

La disposition des embranchements et leur apparente régularité évoquent une structure fractale (Weibel,1977) ; l’arborescence du poumon prend son origine dans une régulation de certains gènes actifs : epithelial growth factor, activines et follistatines, laminine pendant la période embryonnaire.

Ce sont ces mêmes gènes qui sont actifs lors de la croissance et de l’arborescence d’un ensemble d’organes glandulaires, glandes salivaires et pancréatiques en particulier, mais aussi au niveau des reins.

Il semblerait cependant que ce soit la rencontre de deux zones de croissance, une zone bronchique centrale et une zone périphérique acinoalvéolaire qui crée la structure finale.

Le modèle fractal pur, qui prévaut pour la modélisation physiologique de la ventilation ne pourrait ainsi plus être conservé.

Mécanique ventilatoire et aérolique fine :

D’autres observations viennent compléter notre compréhension des phénomènes ventilatoires et éloigner les théories classiques concernant la dispersion homogène des aérosols qui ont prévalu jusqu’à maintenant.

Il apparaît clairement que l’aérolique des alvéoles est sensiblement plus complexe qu’un simple flux et reflux.

Une partie importante de la masse d’air inspirée séjourne pendant plusieurs cycles ventilatoires dans les acini.

L’étude de cette cinétique ventilatoire va permettre de mieux comprendre les limites des modèles actuels utilisés en physiologie et d’apporter une compréhension plus fine des régulations des échanges gazeux et sanguins que les modèles de morphométrie classique et de stéréologie ne font que deviner.

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