Rappel : Définition et méthode d’analyse d’un marqueur moléculaire RFLP
par southern blot.
Le génome d’une espèce contient, dans sa séquence nucléotidique, des sites
de restriction reconnus par des endonucléases.
Certains de ces sites sont invariants
et toujours présents. D’autres sont facultatifs et constituent un marqueur
RFLP (polymorphisme de la longueur des fragments de restriction).
En effet,
selon que le site est présent ou absent, l’action de l’endonucléase, à cet endroit
du génome, générera deux fragments « courts » ou bien un seul fragment
« long ».
L’analyse d’un marqueur RFLP peut être réalisée si on dispose d’une sonde
génomique (marquée) ayant une partie commune avec au moins un des deux
fragments, ou les deux fragments.
La procédure expérimentale consiste à effectuer une digestion totale de
l’ADN génomique de l’individu étudié par l’endonucléase correspondant au
site facultatif du marqueur analysé, puis à séparer les fragments par électrophorèse,
à transférer ces fragments, après dénaturation, sur une membrane
(southern blot), à hybrider ce southern blot avec la sonde marquée afin d’identifier
la présence ou l’absence du fragment « long » ou des deux fragments
« courts », ce qui permet d’en déduire le génotype de l’individu pour le
marqueur RFLP analysé.
Une autre procédure peut être appliquée quand on dispose d’amorces spécifiques
permettant d’amplifier par PCR le fragment génomique contenant le site
facultatif.
Il suffit alors de faire agir l’endonucléase sur les produits de PCR et
de visualiser la taille des fragments après électrophorèse sur un gel de
polyacrilamide.
NB : Pour chaque marqueur RFLP, la présence du site facultatif est notée
« + » et son absence « – ».
Les deux formes « alléliques » d’un marqueur mi seront donc notées mi+
et mi–, selon que le site facultatif relatif à ce marqueur est présent ou absent
sur le fragment génomique testé.
On a réalisé, chez coli, une banque d’ADN génomique de Drosophila
melanogaster, par clonage dans un plasmide, de fragments d’ADN génomique
de drosophile.
Reprenant un à un quelques clones de cette banque, on a isolé trois clones,
nommés S1, S2 et S3, dont les plasmides, utilisés comme sonde, se révèlent
capables d’identifier trois marqueurs RFLP du génome de drosophile,
notés m1, m2 et m3.
Pour étudier ces trois marqueurs, on extrait l’ADN d’individus de deux
souches pures de drosophiles, A et B, et d’individus F1 issus du croisement
A × B.
L’ADN extrait est réparti en trois fractions.
Chaque fraction est soumise à
l’action d’une enzyme, TaqI, ou HindIII, ou EcoRI; puis les fragments de
digestion sont séparés par électrophorèse sur gel d’agarose, dénaturés et
transférés sur des membranes de nylon (southern-blot) qui sont respectivement
hybridées par les sondes marquées S1 (pour les fragments TaqI),
S2 (pour les fragments HindIII), et S3 (pour les fragments EcoRI).
Après
lavage, les membranes sont autoradioagraphiées (si marquage radioactif)
ou révélées (si marquage froid). Le pattern de fragments hybridés par les
sondes est présenté à la figure 11.3.
1. Justifiez l’étape de dénaturation de l’ADN avant le transfert sur la
membrane de nylon.
2. Pour chacune des souches (A, B et F1) vous définirez le génotype pour
chacun des marqueurs RFLP (en utilisant la nomenclature définie au nota
bene plus haut).
3. Pour chacune des souches (A et B) vous établirez une carte de restriction
précise au locus de chacun des trois marqueurs RFLP, en mentionnant les
sites invariants et le site facultatif, et en positionnant à chaque fois la sonde
S par rapport aux fragments qu’elle reconnaît sur le southern.
4. L’ADN des mâles F1 présente, pour chaque marqueur, le même profil
d’hybridation, que ce mâle soit issu d’un croisement mâle A × femelle B
ou d’un croisement mâle B × femelle A.
Qu’en déduisez-vous ?
Qu’aurait-on dû observer dans le cas contraire ?
Faites un schéma explicite (le seul cas m1 suffit).
5. Les individus F1 sont croisés entre eux et on entreprend l’analyse individuelle
de l’ADN de 400 individus F2 (chaque individu est écrasé dans un
tube et son ADN est extrait), afin d’établir le profil d’hybridation relatif à
chacun des marqueurs m1, m2 et m3.
Pour chaque marqueur, on peut identifier un profil de type A (profil
parental correspondant au premier profil sur les southern présentés plus
haut), ou un profil de type B, ou un profil de type F1.
L’analyse de chaque marqueur considéré isolément donne les résultats
suivants (tabl. 11.1).
a. Qu’en concluez-vous ?
Vous justifierez votre conclusion, pour le
marqueur m3, par un test statistique.
b. Pourquoi, contrairement à des phénotypes morphologiques ou biochimiques,
ce résultat était-il le seul possible ?
6. On a montré que les marqueurs m1 et m2 étaient physiquement indépendants.
Vous ferez un schéma clair et précis de la méiose, chez la F1, pour
ces deux marqueurs, montrant, sur le plan génétique, les différentes issues
possibles de cette méiose (noter les « allèles » tels qu’indiqués dans le NB
du rappel). Les centromères doivent obligatoirement figurer sur ce schéma.
7. On analyse à présent la ségrégation simultanée des profils d’hybridation
pour les deux marqueurs m2 et m3.
Pour cela, on reprend les 400 individus
F2, obtenus précédemment (dans le croisement F1 × F1 de la question
4); cela permet de les classer, selon que les profils observés, pour
chacun des deux marqueurs, sont de type A, B ou F1 (tabl. 11.2).
a. Vous donnerez une interprétation cartographique précise de ces résultats
pour les marqueurs m2 et m3.
Vos réponses doivent être justifiées, votre
argumentation peut s’appuyer sur un schéma de la méiose.
Il vous est
conseillé de faire un raisonnement fondé sur le taux r de recombinaison
entre ces marqueurs (r = fréquence des gamètes recombinés), puis de faire
l’application numérique.
b. Deux autres situations cartographiques étaient a priori possibles,
lesquelles ?
Précisez, dans chacune de ces deux situations cartographiques, quelles
auraient été les valeurs (en fréquences ou en %) en construisant un tableau
semblable au tableau 11.2.
Valeurs seuil du χ2 :
Solution
1. La dénaturation des fragments de restriction est nécessaire pour permettre l’hybridation
moléculaire, au niveau des séquences homologues entre la sonde et les fragments de restriction
issus de la digestion au niveau du locus du marqueur étudié.
NB : La sonde S1 reconnaît les deux fragments RFLP car elle a une partie commune avec
chacun d’eux.
NB : La sonde S3 est homologue à une séquence interne au fragment de 2,0 Kb : elle hybride
évidemment avec celui de 2,5 Kb, mais n’hybride pas avec celui de 0,5 Kb.
