Introduction :

La bactériologie des mycobactéries pourrait ressembler à un ensemble uniforme, résistant au changement si l’on ne tenait compte que de la difficulté de travailler avec ces bactéries.

Mais depuis quelques années, et la parution de différents ouvrages, de nombreuses nouveautés sont apparues grâce à l’utilisation des techniques de biologie moléculaire.

L’avancée la plus importante et la plus récente concerne la connaissance de la séquence du génome de M. tuberculosis souche H37Rv.

Les techniques moléculaires ont modifié l’approche diagnostique, pour détecter ou pour identifier ces bactéries.

Elles ont permis également de mieux appréhender l’épidémiologie actuelle de la tuberculose ou des mycobactérioses, et enfin elles ont élucidé les mécanismes de résistance aux antibiotiques antituberculeux.

Associés aux techniques de biologie moléculaire, des progrès importants ont été réalisés dans le cadre du diagnostic bactériologique, pour rendre plus rapidement un résultat au clinicien.

L’utilisation de milieux liquides a amélioré la sensibilité de la culture et raccourci le délai de détection de la sensibilité aux antituberculeux.

Une autre avancée notoire a été la reconnaissance du rôle pathogène opportuniste de certaines mycobactéries atypiques, notamment chez les sujets immunodéprimés, et surtout de la difficulté de traiter ces infections à cause d’une résistance naturelle de ces bactéries aux antibiotiques antituberculeux.

Enfin, la susceptibilité individuelle de l’hôte intervient dans ses relations avec les mycobactéries.

Certaines réponses immunologiques peuvent permettre d’esquisser l’issue de ce conflit, sans en révéler malheureusement tous les mécanismes, et notamment comment M. tuberculosis reste présent de manière prolongée au sein de l’hôte.

Le diagnostic bactériologique joue un rôle important, individuellement pour chaque sujet infecté avec une obligation de la mesure de la sensibilité aux antibiotiques pour une meilleure adaptabilité du traitement, mais également pour notre société avec la recherche de sujets contacts, notamment les enfants au contact de parents tuberculeux et bacillifères, et donc la mise en place d’un isolement et d’une enquête de santé publique pour déterminer le cas index à partir duquel a été disséminé M. tuberculosis.

Nous pouvons donc envisager la bactériologie des mycobactéries comme un domaine en pleine évolution, avec l’obligation d’utiliser encore les tests classiques ou dits de référence pour la détection, l’identification et la détermination de la sensibilité aux antituberculeux, et le choix d’utiliser une approche moléculaire et une approche indirecte à l’aide de marqueurs immunologiques pour un diagnostic précoce de l’infection.

Ces différents domaines seront donc analysés en fonction de leurs avantages et inconvénients respectifs tout au long de ce chapitre.

Historique :

Quand JA Villemin disparut le 6 octobre 1892, ses démonstrations expérimentales affirmant le caractère transmissible de la tuberculose avaient été généralement acceptées, sauf par certains.

Les opposants de Villemin pensaient que la tuberculose était héréditaire.

Et malgré la découverte en 1882 par Koch du bacille de la tuberculose, ces travaux révolutionnaires à cette époque ont été finalement ignorés, voire tout simplement oubliés.

Selon une histoire à peu près similaire, la découverte d’un vaccin contre la tuberculose en 1921, le bacille Calmette-Guérin (BCG), puis son utilisation et la démonstration de son efficacité ont fait l’objet de nombreuses controverses.

Ceci démontre l’impact créé par cette maladie sur la population humaine et sur notre monde scientifique.

La tuberculose est apparue probablement comme une maladie endémique chez l’animal bien avant qu’elle n’atteigne l’homme.

M. bovis était sûrement le micro-organisme infectant, et les premières infections humaines étaient dues à cette bactérie.

Sachant également que M. tuberculosis infecte les différentes espèces de primates, il est possible que M. tuberculosis ait été présent chez ces espèces ancêtres de l’homme, avant de s’implanter définitivement chez l’homme.

Une étude moléculaire récente tend à démontrer que la première hypothèse serait la plus vraisemblable.

M. tuberculosis aurait choisi de s’implanter chez l’homme lorsque celui-ci a domestiqué le bétail il y a un peu plus de 10 000 ans.

La diffusion épidémique de M. tuberculosis a ensuite commencé lors des périodes progressives d’urbanisation avec l’augmentation de la densité des populations.

Le taux de mortalité en absence de tout traitement étant de 50 %, un premier contact entre M. tuberculosis et une population naïve a dû avoir des conséquences dramatiques.

En fait, lorsque le temps de génération de l’hôte est supérieur à celui du parasite, comme c’est le cas entre M. tuberculosis et l’homme, l’hôte ne peut alors s’adapter aussi vite que le parasite.

Initialement, celui-ci présente donc un avantage, entraînant l’élimination des sujets susceptibles avant que ceux-ci n’aient eu le temps de transmettre leur capital génétique à leur descendance.

Cette théorie permet d’expliquer initialement la diffusion épidémique de la tuberculose et ensuite son déclin progressif dans une population donnée.

À travers le monde, cette diffusion s’est effectuée à différentes périodes en fonction des voyages réalisés par les Européens colonisant les différentes parties du globe.

Entre 1700 et 1800, la prévalence de la tuberculose était à son maximum en Europe et aux États-Unis, et entre 100 et 200 ans plus tard, cette maladie a diffusé en Europe de l’Est, en Asie, en Afrique et en Amérique du sud.

Au sein d’une population particulière, dans une région géographique définie, l’épidémie de tuberculose atteint son maximum en 50-75 ans, avant de décliner du fait de la sélection d’hôte de plus en plus résistant.

En cette fin de XXe siècle, M. tuberculosis reste malgré tout l’agent infectieux le plus meurtrier dans le monde, et principalement dans les pays de précarité socioéconomique, avec près de 30 millions de décès pour cette dernière décennie.

Quatre-vingt-quinze pour cent des cas déclarés le sont dans ces pays de précarité socioéconomique, où deux problèmes principaux émergent : l’association mortelle entre le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) et le bacille de la tuberculose, et les nombreux conflits entraînant des déplacements et l’expatriation en masse de population.

Les 5 % restants sont retrouvés au sein des pays développés, avec dans une majorité des cas le rôle certain de la précarité et des mauvaises conditions socioéconomiques, mais également de la défaillance de certains systèmes de santé et de prévention.

Une condition aggravante de ce problème de santé publique est l’émergence et la diffusion de souches multirésistantes au traitement antituberculeux de première intention.

La raison principale est la mauvaise compliance au traitement long, coûteux et non dénué d’effets secondaires. Pour les mycobactéries atypiques, la relation entre agent infectieux et pathologie a été longue à se dessiner.

Ce n’est qu’en 1920 que Calmette envisage l’existence de mycobactéries autres que M. tuberculosis et M. bovis comme agents responsables d’infection chez l’homme.

De nombreuses observations sont maintenant publiées, dont certaines ont été réactualisées, notamment à l’issue de l’apparition du syndrome d’immunodéficience acquise. Plusieurs classifications ont été établies, la dernière utilisée étant celle de Runyon basée sur les critères de croissance et de coloration en présence ou absence de lumière.

Avec l’ère de la taxonomie moléculaire, cette classification reste très utilisée comme base d’identification pratique des mycobactéries atypiques.

Caractères généraux des mycobactéries :

A - Taxonomie :

Les mycobactéries appartiennent à la famille des Mycobacteriaceae comprenant un seul genre : le genre Mycobacterium.

Le contenu en guanine + cytosine (GC %) est élevé, compris entre 60 et 72 %.

Le genre Mycobacterium est séparé en de nombreuses espèces (>= 50) dont certaines sont regroupées sur la base d’un parasitisme strict de l’homme et l’animal et d’une vitesse de croissance lente (> 7 jours).

Ces espèces appartiennent au complexe tuberculosis responsable de la tuberculose, et comprenant M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. microti.

On distingue également M. leprae, espèce toujours non cultivable in vitro, agent de la lèpre.

À l’opposé, on distingue les mycobactéries dites à « croissance rapide » ou mycobactéries non tuberculeuses (Mott) ou atypiques.

De nombreuses espèces sont classées en quatre groupes, certaines pathogènes vraies comme M. ulcerans et M. marinum, certaines présentant le caractère de pathogène opportuniste, d’autres considérées comme saprophytes pour l’homme et l’animal.

Au sein de chaque groupe, les espèces sont différenciées à l’aide de tests enzymatiques, et plus récemment par des méthodes d’hybridation moléculaire à l’aide de sondes nucléiques spécifiques.

En dehors de la vitesse de croissance, des différences quant à l’habitat, la contagiosité et la sensibilité aux antibiotiques existent entre les mycobactéries atypiques et les mycobactéries appartenant au complexe tuberculosis.

M. tuberculosis est très contagieux, transmis par des gouttelettes fines lors de toux ou d’expectorations par les patients bacillifères.

Il n’est jamais retrouvé libre dans le milieu extérieur, ou tout du moins pas pendant une période prolongée. Sa transmission est toujours directe, d’hôte infecté à hôte sain.

Les mycobactéries atypiques, responsables d’infections chez l’homme n’ont jamais démontré une contagiosité avec transmission directe.

Elles sont ubiquistes, présentes en grande quantité dans l’environnement, et sont considérées comme pathogènes opportunistes par opposition à M. tuberculosis, pathogène strict.

La classification des mycobactéries atypiques est constamment en évolution, grâce notamment à l’utilisation de techniques de biologie moléculaire.

Ces techniques ont permis la séparation de certaines espèces entre elles, comme par exemple la séparation de M. scrofulaceum du complexe aviaire, ou bien le typage moléculaire des différents sérovars du complexe aviaire, ou encore la nouvelle dénomination de M. paratuberculosis comme sous-espèce de M. avium.

De nouvelles espèces ont récemment été impliquées dans des infections chez l’hôte immunodéprimé comme M. asiaticum, M. haemophilum, M. malmoense, M. shimodei et, récemment, M. smegmatis.

B - Habitat naturel, résistance dans l’environnement :

Parmi les nombreuses mycobactéries actuellement reconnues, un petit nombre n’a jamais été isolé de l’environnement.

Il s’agit des mycobactéries appartenant au groupe tuberculosis et certaines espèces ayant des exigences nutritives particulières.

Les autres espèces retrouvées sont dites ubiquistes, présentes aussi bien dans l’eau, le sol, la végétation ou les poussières.

Les mycobactéries peuvent en effet se multiplier dans une large gamme de pH, de température et de concentration en chlore ou en métaux lourds.

Elles résistent également à de nombreux antibiotiques naturellement produits par les champignons dans l’environnement.

M. kansasii et M. xenopi ne sont jamais retrouvés dans le sol et l’eau de ruissellement, mais sont des contaminants de l’eau potable et de l’eau distillée.

M. gordonae, en revanche, est plus ubiquiste, car on la retrouve à peu près partout, et notamment dans l’eau du robinet.

M. avium présente grossièrement le même habitat que M. fortuitum et les mycobactéries appartenant au complexe terrae.

Mais sa fréquence d’isolement varie selon les publications, indiquant par là une variation en fonction de régions géographiques : son isolement est peu fréquent dans les eaux naturelles en France, et comparativement on la retrouve en grande quantité sur la côte Est des États-Unis.

Des exemples similaires sont retrouvés pour M. xenopi ou M. malmoense.

De façon apparemment paradoxale, il n’y a pas de corrélation stricte entre fréquence d’isolement dans l’environnement et fréquence des infections : M. avium reste, malgré les différences régionales, la mycobactérie le plus fréquemment isolée chez les sujets VIH positifs .

Cette omniprésence des mycobactéries dans l’environnement a été à l’origine de diagnostics faussement positifs, mais surtout d’infections iatrogènes liées à des actes chirurgicaux et médicaux avec du matériel insuffisamment décontaminé.

Le principal problème est de reconnaître que la mycobactérie isolée est bien l’agent pathogène.

À l’exception de M. marinum, toujours considérée comme pathogène lorsqu’elle est isolée, de même que M. ulcerans, la question demeure, pour les autres mycobactéries, de faire la différence entre colonisation et infection.

On observe globalement une colonisation par les mycobactéries atypiques des voies aériennes supérieures, du tractus digestif et de la peau.

Les mycobactéries du complexe avium, M. simiae, M. scrofulaceum, M. szulgai et M. fortuitum ont toutes été isolées de la peau saine. De même, les infections à M. kansasii peuvent être provoquées par les aérosols produits lors de douches.

La difficulté de reconnaître ces bactéries comme responsables d’une infection vient du fait qu’elles se retrouvent fréquemment isolées comme contaminants.

Ces bactéries présentent en effet deux inconvénients :

– une plus grande résistance aux agents chimiques et physiques, propriété que l’on utilise d’ailleurs pour réaliser la décontamination des prélèvements ;

– leur sensibilité est différente selon que ces bactéries sont maintenues en culture ou bien mises en présence de liquides biologiques ou d’échantillons tissulaires.

Actuellement, le formaldéhyde ou le glutaraldéhyde sont préconisés pour la décontamination de matériel tel qu’appareils à dialyse ou bronchoscopes et endoscopes, mais de nouvelles techniques (sonication en bain-marie, par exemple), moins drastiques pour le matériel, sont à l’étude.

Il est important de noter que les mycobactéries sont sensibles au traitement de l’eau au chlore ou à l’ozone, et on ne les retrouve pas à la sortie des usines de traitement des eaux, l’eau potable étant à ce niveau dépourvue de mycobactéries.

La contamination survient donc ultérieurement.

C - Caractères structuraux et métaboliques :

Les mycobactéries se présentent sous la forme de bacilles fins, légèrement incurvés, pouvant présenter un aspect en échelle (M. kansasii), ou avoir une forme plus coccobacillaire (M. avium).

Leur longueur varie entre 2 et 12 µm, les bacilles les plus allongés étant observés par exemple pour M. xenopi, et leur diamètre est compris entre 0,2 et 0,3 µm.

En milieu solide, principalement sur milieux à l’oeuf, les mycobactéries donnent des colonies d’aspect caractéristique (aspect en « chou-fleur » pour M. tuberculosis) ; de même l’examen direct des cultures en milieu liquide montre un aspect caractéristique, en cordes par exemple pour M. tuberculosis ou M. marinum.

Ces bactéries sont immobiles, aérobies strictes, non capsulées, asporulées et, du fait de la structure de leur paroi, ne prennent pas les colorants usuels comme ceux utilisés pour la coloration de Gram.

Elles font partie malgré cela, de par leur organisation structurale, des bactéries dites à Gram positif.

Elles sont capables en revanche d’être colorées par la fuchsine ou l’auramine et de conserver ces colorants malgré l’action conjointe de l’acide et de l’alcool.

Elles sont dites acido-alcoolo-résistantes, appelées de fait bacilles acidoalcoolo-résistants (BAAR).

Cette propriété peut être perdue partiellement par certaines mycobactéries ayant une croissance rapide, ou lors de croissance en modèle cellulaire in vitro.

Les mycobactéries sont des bactéries exigeantes, certaines ayant des exigences nutritives particulières comme des besoins en hémine et fer (exemple : M. haemophilum), en mycobactine et autres transporteurs de fer (exemple : M. avium subsp paratuberculosis et subsp silvaticum, M. celatum) ou en pyruvate de sodium (exemple : M. africanum).

Les sels d’ammonium ou les acides aminés sont la source d’azote, le glycérol étant la principale source de carbone.

La température de croissance varie de 30 °C pour M. marinum ou M. ulcerans par exemple, à 42 °C pour M. xenopi, voire jusqu’à 45 °C.

Le temps de génération varie entre 2 et 20 heures en milieu de culture semi-synthétique, d’où un délai d’apparition des colonies entre 2 et plus de 8 jours.

Des activités enzymatiques sont retrouvées pour chaque espèce, servant de base aux tests d’identification biochimiques.

D - Paroi des mycobactéries :

Les mycobactéries font partie des eubactéries, appartenant à un groupe plus large de bactéries à Gram positif ayant un GC % élevé, appelé Actinomycetales.

Ces bactéries produisent une paroi de structure unique contenant de l’acide méso-diaminopimélique comme acide diaminé pontant au sein du peptidoglycane. Deux particularités existent chez ces bactéries :

– l’acide muramique, composant essentiel du peptidoglycane, est glycolylé et non acétylé, proposant ainsi d’autres possibilités de liaison hydrogène rendant la structure très stable ;

– la présence d’un oligosaccharide unique, l’arabinogalactane, lié aux acides mycoliques.

Les acides mycoliques sont des acides gras alpha-alkylés bêta-hydroxylés, présents principalement sous forme d’esters d’acides gras (exemple : penta-arabinosyl mycolate, tréhalose 6-6 dimycolate ou cord factor...).

Les différences entre les mycobactéries et les corynébactéries ou les Nocardia viennent de la longueur de la chaîne carbonée, respectivement de C60-C90 contre C40-C60.

Elles viennent également d’une différence structurale avec la présence de chaînes alpha branchées (C20-C25), la présence de double liaison et de groupement cyclopropane permettant à la molécule de changer d’orientation.

Un modèle d’organisation physique a été proposé par Minnikin, il y a maintenant presque 10 ans, où les chaînes d’acides mycoliques sont agencées l’une à côté de l’autre dans une direction perpendiculaire au plan de la surface cellulaire.

Il était également proposé que les acides mycoliques, formant un feuillet interne, étaient recouverts par un feuillet externe de lipides solubles ou extractibles, l’ensemble donnant l’aspect d’une bicouche lipidique asymétrique.

À cette structure s’ajoute la présence de porines, récemment décrites chez M. chelonae et chez M. smegmatis.

Ces structures lipidiques extractibles à l’aide de solvants sont représentées par le lipo-oligosaccharide (LOS), le lipoarabinomannane (LAM), des glycolipides phénoliques (PGLs)...

Certains de ces composés sont spécifiques d’espèce, permettant leur identification par chromatographie liquide haute performance (HPLC).

On retrouve notamment des composés spécifiques des mycobactéries à croissance lente, comme le cord factor, ou le 2-3 di-O-acyltréhalose (DAT) et certains sulfolipides.

Ce sont des antigènes importants, provoquant la synthèse d’anticorps dont la détection sérologique peut servir de base à un diagnostic indirect.

La membrane cytoplasmique est également particulière.

Elle est asymétrique avec un feuillet externe plus dense que le feuillet interne.

Ceci est dû à la présence de phosphatidylinositol- mannoside (PIM), préférentiellement localisé à la surface du feuillet externe.

Ces composés sont spécifiques des bactéries de la lignée des Actinomycétales et favorisent l’ancrage du LAM et du lipomannane.

Parmi les autres composants membranaires, on retrouve des caroténoïdes responsables de la pigmentation et de la photoprotection, et des ménaquinones impliquées dans le transport d’électrons.

L’ensemble ainsi décrit concourt à une extrême rigidité et une très faible perméabilité.

De la surface de la membrane cytoplasmique jusqu’à l’extrémité de la paroi s’établit un gradient de fluidité, allant de faible à fort.

Ce gradient est inversement proportionnel à la perméabilité, donc celle-ci est très faible à l’extrémité de la paroi.

Cela concerne principalement les composés hydrophobes, qui n’ont d’autre choix que de traverser cette organisation, étant exclus de la voie des porines.

Les antibiotiques lipophiles comme les rifamycines, les tétracyclines, les macrolides et les fluoroquinolones utilisent cette voie. Les porines jouent un rôle mineur dans la perméabilité, car elles sont en nombre faible à la surface de la bactérie et, comparativement aux entérobactéries, ces porines ont un diamètre réduit.

Il existe entre les mycobactéries des différences de susceptibilité aux désinfectants ou aux agents antibactériens, avec une plus grande sensibilité chez M. tuberculosis, et cette différence est due à la composition de leur paroi.

Par exemple, la résistance de M. chelonae à l’éthambutol est expliquée par une plus faible perméabilité chez cette bactérie comparativement à M. tuberculosis.

De même, l’ajout d’un groupe lipophile à l’isoniazide (l’acide palmitique), améliore son activité vis-à-vis de M. avium.

La très faible perméabilité de la paroi des mycobactéries, bien que nécessaire, n’est pas suffisante en soi pour l’expression de la résistance de ces bactéries à de nombreux antibiotiques.

On distingue la présence associée de mécanismes d’inactivation enzymatique (exemple : aminosides), ou l’existence de système d’efflux responsable de l’expulsion de l’antibiotique (tétracyclines, fluoroquinolones...).

E - Caractères génétiques des mycobactéries :

Le génome de M. tuberculosis souche H37Rv, dont la séquence totale est maintenant connue, a une taille de 4 411 529 paires de bases (bp), avec un GC % de 65,6 %.

Il comprend un nombre important d’acides désoxyribonucléiques (ADN) répétitifs, parmi lesquels sont retrouvées des séquences d’insertion.

Seize copies d’IS6110 et six copies d’IS1081, ainsi que 32 nouvelles séquences d’insertion ont été identifiées.

Les nouvelles séquences d’insertion appartiennent à la famille des IS3 et IS256, et des similitudes existent entre ces éléments et ceux retrouvés chez Nocardia et Rhodococcus, indiquant une diffusion large au sein des Actinomycétales.

Les séquences d’insertion (IS6110, IS1081) sont utilisées dans les techniques de génotypage moléculaire des isolats cliniques de M. tuberculosis, et représentent le principal élément de variabilité entre les souches.

En effet, le génome de M. tuberculosis est très stable, avec de rares changements entre nucléotides comme le montre une étude récente sur le séquençage d’une partie du génome de nombreux isolats cliniques.

Soit ce génome est inerte, soit M. tuberculosis est un organisme relativement récent en termes d’évolution. On distingue également la présence de familles de gènes, et de nombreuses duplications de gènes métaboliques.

Deux prophages ont été détectés (phiRv1, phiRv2) d’une taille de 10 kb.

Certains produits de leurs gènes sont homologues à des produits similaires élaborés par des phages retrouvés chez les Streptomyces.

La capacité codante, correspondant au pourcentage de gènes exprimés, est de 91 %, avec 40 % de gènes pour lesquels une fonction précise a pu être attribuée, et 44 % pour lesquels cette fonction est supposée, sur la base de comparaison des séquences connues d’ADN pour d’autres micro-organismes.

La faible vitesse de croissance, ainsi que l’irrégularité des cycles de réplication, s’expliqueraient par l’existence d’une part d’un seul opéron ribosomal situé à 1 500 kb de l’origine de réplication, et d’autre part au fait que seulement 59 %(75 %chez Escherichia coli) des gènes sont transcrits dans le même sens que la fourche de réplication.

En effet, les gènes situés à proximité de l’origine de réplication, ou transcrits dans le même sens que la fourche de réplication de l’ADN, le sont avec une plus grande efficacité, comparativement à ceux localisés loin de l’origine ou transcrits dans le sens inverse de la fourche de réplication.

L’ensemble des produits du métabolisme azoté, carboné est présent, mais la particularité de M. tuberculosis est de posséder un arsenal impressionnant d’enzymes (>= 250) impliquées dans le métabolisme lipidique.

Ceci se conçoit quand on connaît la structure pariétale de ces bactéries, et ces enzymes représentent de potentielles cibles thérapeutiques pour le futur développement d’antibiotiques antituberculeux.

M. tuberculosis possède également tout le matériel génétique nécessaire à sa survie en absence d’oxygène, ce qui permet de spéculer sur la persistance de cette bactérie chez l’hôte au sein des lésions granulomateuses.

Dix pour cent du génome codent pour des familles de protéines acides riches en glycine (PPE, PE).

La fonction de ces protéines n’est pas connue, mais du fait de leur nombre et de leur caractéristique, elles pourraient intervenir dans l’échappement de M. tuberculosis aux défenses immunitaires de l’hôte.

Peu de facteurs de virulence sont décrits : la catalase-peroxydase, un facteur de colonisation des macrophages (Mce), ainsi qu’un gène erp codant pour une protéine exportée ont été impliqués dans l’expression de la virulence de M. tuberculosis.

Diagnostic au laboratoire des infections à mycobactéries :

Ce diagnostic est commun à l’ensemble des mycobactéries.

Seule différera l’approche technique concernant l’identification de chaque mycobactérie isolée d’un prélèvement.

L’un des soucis principaux que pose le diagnostic bactériologique des infections à mycobactéries, est le délai de positivité des cultures et, par voie de conséquence, le rendu de l’identification et de l’antibiogramme.

Ce handicap est dû à la lenteur de croissance de ces bactéries.

Nous possédons actuellement les moyens pour raccourcir ces délais, et le laboratoire de mycobactériologie doit être à même de s’équiper de manière à rendre un résultat dans des délais raisonnables.

Mais il est fondamental de connaître les avantages et inconvénients de ces nouvelles approches diagnostiques, pour ainsi gérer au mieux ce diagnostic toujours délicat.

A - Prélèvements adressés au laboratoire pour recherche de mycobactéries :

1- Recommandations générales :

Il est impératif d’effectuer le prélèvement si possible avant tout traitement antimycobactérien.

L’utilisation de récipients stériles, à usage unique et à fermeture hermétique, est recommandée.

Il faut éviter la contamination par l’eau du robinet ou tout autre liquide pouvant contenir des mycobactéries de l’environnement vivantes ou non, pouvant être à l’origine d’examen faussement positif.

Les écouvillons ne sont pas conseillés car le volume de prélèvement est insuffisant, un examen direct est impossible, et les mycobactéries se détachent difficilement de la partie cotonnée de l’écouvillon.

Il ne faut pas ajouter de désinfectant ou de conservateur (Bouin) dans les prélèvements.

En cas d’acheminement immédiat au laboratoire impossible, les hémocultures prélevées au lit du malade seront mises à l’étuve ou, à défaut, conservées à température ambiante.

Tous les autres prélèvements dans la mesure du possible, dont ceux potentiellement contaminés, seront conservés à + 4 °C jusqu’au transfert au laboratoire, évitant ainsi une prolifération bactérienne trop importante.

2- Modalités de prélèvement :

* Prélèvements d’origine pulmonaire :

L’émission de bacilles étant discontinue, les expectorations seront recueillies 3 jours de suite.

Un nombre supérieur d’expectorations n’augmente pas le taux de positivité.

Les expectorations doivent être recueillies le matin à jeun, après brossage des dents et rincage de la bouche à l’eau.

Chaque prélèvement fait l’objet d’un examen séparé, il convient de ne pas mélanger les crachats prélevés des jours différents (augmentation du risque de contamination et diminution de la sensibilité).

En cas de négativité de ces expectorations, ou devant la difficulté pour un patient d’émettre des crachats de qualité, des crachats induits, émis après inhalation d’aérosols d’eau physiologique stérile, seront recueillis par un personnel compétent, protégé (masque) pour diminuer les risques de contamination de celui-ci.

Les produits d’aspiration trachéale ou trachéobronchique chez les malades intubés seront recueillis à l’aide d’une sonde d’aspiration, introduite par la canule d’intubation, pour aspirer les sécrétions de l’arbre respiratoire.

Celles-ci seront manipulées de la même façon qu’un crachat.

Si le patient a également des difficultés pour cracher, des tubages gastriques seront réalisés.

Ceci consiste à prélever directement dans l’estomac les sécrétions bronchiques qui ont été dégluties inconsciemment pendant le sommeil.

Cette épreuve sera réalisée chez un sujet maintenu à jeun, alité depuis la veille au soir et le plus tôt possible après le réveil.

Le tubage gastrique doit être réalisé 3 jours de suite.

En cas de négativité de ces prélèvements, il peut être nécessaire de réaliser des prélèvements pulmonaires sous fibroscopie.

Ces prélèvements sont obtenus sous contrôle de la vue grâce à l’introduction d’un fibroscope qui permet de réaliser des prélèvements au niveau d’une zone anormale.

Les produits d’aspiration bronchique sont dilués dans de l’eau distillée stérile et recueillis dans un flacon stérile.

Ils sont traités comme un crachat, de même que le lavage bronchoalvéolaire.

La biopsie pulmonaire doit être traitée comme un prélèvement non contaminé.

La fibroscopie étant responsable d’une irritation, celle-ci se manifeste dans les heures qui suivent par l’émission de crachats.

Il est important, alors, de recueillir trois crachats successifs, postfibroscopie, car leur taux de positivité est supérieur aux crachats réalisés préalablement à la fibroaspiration.

* Autres prélèvements :

Les liquides de ponction comme le liquide pleural, le liquide d’ascite, les liquides articulaires, la moelle osseuse..., seront prélevés sur anticoagulant en utilisant de l’héparine, et non de l’éthylène-diamine-tétra-acétique (EDTA) qui inhibe la croissance des mycobactéries.

Il est important de recueillir le maximum de volume car il s’agit de prélèvements souvent paucibacillaires.

La présence de mycobactéries dans le sang est constante mais faible.

Elle est plus souvent retrouvée chez les sujets immunodéprimés.

On pratiquera deux, voire trois prélèvements successifs, et les prélèvements seront répétés, en cas de négativité de la culture, 3 semaines après.

Le prélèvement d’urines pour la recherche de mycobactéries portera sur la totalité des urines émises au lever, après restriction hydrique sur la nuit, et elles seront recueillies stérilement.

On réalisera cette recherche après avoir vérifié la présence d’une leucocyturie (> 10/mm3) et l’absence de germes banals grâce à un examen cytobactériologique préalable des urines.

Cette recherche pourra être effectuée chez les sujets immunodéprimés (VIH positifs) en cas d’autres prélèvements négatifs chez ces patients, même en l’absence de leucocyturie, et devant une forte suspicion de tuberculose.

Il est important de réaliser trois prélèvements successifs à 3 jours d’intervalle.

Le prélèvement de selles est de moins en moins conseillé, du fait de l’importance de la contamination par la flore fécale. Un gramme de selles est suffisant dans un pot stérile pouvant être conservé au froid (+ 4 °C), sur lequel peut être essentiellement réalisé un examen direct par la technique de Ziehl-Neelsen.

Les prélèvements tissulaires (ganglions, foie, poumon, peau, os,...) doivent être réalisés le plus stérilement possible, car on évite ainsi une étape de décontamination sur des échantillons généralement pauvres en mycobactéries, et être acheminés le plus rapidement possible au laboratoire pour éviter la dessiccation des prélèvements de faible volume.

Les abcès, les lésions cutanées ou plaies et les liquides d’aspiration seront réalisés après désinfection de la peau à l’alcool.

Il est préférable de ponctionner le liquide et de le transvaser dans un tube sec stérile.

Pour les lésions cutanées, une biopsie sera réalisée à la périphérie de la lésion.

B - Diagnostic direct des infections à mycobactéries :

1- Décontamination - concentration :

Connaissant la lenteur de croissance de ces bactéries, ainsi que leurs exigences nutritives, il est important d’éliminer toute flore commensale préalablement à l’ensemencement des prélèvements.

On réalise donc une décontamination du prélèvement.

On considère de manière simple que tout prélèvement provenant de lésions ouvertes (respiratoires, urinaires, selles, fistules...) subit une décontamination.

Tout prélèvement provenant de lésions fermées (liquide céphalorachidien [LCR], liquide de séreuses, pus...) est directement ensemencé.

Quatre méthodes de décontamination sont actuellement préconisées pour réaliser cette décontamination.

On distingue une décontamination à la soude à 4 % (méthode de Petroff), une décontamination à l’acétylcystéine et à la soude (méthode de Kubica), une décontamination au lauryl sulfate de sodium (méthode de Tacquet-Tison) et, enfin, une décontamination à l’acide sulfurique à 4 % (méthode de Löwenstein).

Ces méthodes font intervenir plusieurs étapes.

Tout d’abord une étape de décontamination-fluidification de l’échantillon, permettant d’éliminer les bactéries de la flore contaminante.

Cette étape est très importante avec un temps précis à respecter, car les mycobactéries sont sensibles à l’action de ces produits : entre 50 et 90 %des mycobactéries sont tuées à l’issue de ce traitement.

En respectant le temps d’incubation, on évite de tuer trop de mycobactéries, tout en éliminant tous les contaminants.

Cet équilibre, délicat à respecter, est en fait contrôlé sur une période donnée, en calculant soit l’indice de positivité des cultures, soit le taux de contamination qui doit se situer entre 2 et 5 %.

Cette étape est suivie d’une neutralisation puis d’une centrifugation.

Le culot de centrifugation sera alors ensemencé et servira également pour le diagnostic rapide direct par examen microscopique et amplification génique.

La réalisation du frottis pour les prélèvements dits contaminés comme les prélèvements pulmonaires, devra être effectuée après décontamination-concentration, car la concentration du prélèvement permet d’augmenter les chances de retrouver des bacilles à l’examen direct.

2- Examen microscopique, sensibilité et spécificité :

Les mycobactéries, de par la structure de leur paroi, ne prennent pas les colorants usuels, comme ceux utilisés pour la coloration de Gram.

En revanche, elles sont capables, à la différence des bactéries usuelles, de conserver une coloration malgré l’action conjuguée de l’acide et de l’alcool, et sont appelées BAAR.

La structure pariétale, dont nous venons de parler, permet la fixation irréversible de colorants tels que la fuchsine et l’auramine ou la rhodamine, d’où une spécificité de 100 % de cette méthode pour les mycobactéries.

La technique de référence pour colorer ces bactéries est la méthode de Ziehl-Neelsen, utilisant la fuchsine phéniquée à chaud, suivie d’une décoloration par une solution d’acide et d’alcool mélangés, et d’une contre-coloration au bleu de méthylène.

Les mycobactéries apparaissent comme de fins bacilles plus ou moins réguliers, roses sur un fond bleu, bleuvert.

Des techniques rapides à froid comme la méthode de Kinyoun, ont été mises au point pour raccourcir le temps de préparation, mais ne possèdent pas une spécificité suffisante comparativement à la méthode de référence.

L’observation des frottis se fait au grossissement X 100 à l’immersion, du fait de la taille des BAAR, et une observation d’au moins 300 champs est nécessaire avant de rendre un résultat négatif (20 min/lame).

Cela représente l’inconvénient majeur de cette technique pour l’observation en série de nombreux frottis.

Beaucoup de laboratoires l’ont remplacée par la technique de coloration à l’auramine phéniquée, qui présente les mêmes propriétés que la fuchsine pour colorer les mycobactéries.

L’observation est effectuée sur un microscope à fluorescence, à l’objectif X 25, ce qui permet d’examiner la totalité du frottis en 5 minutes, ou moins.

Cette coloration, du fait d’une lecture à un plus faible grossissement, a démontré une meilleure sensibilité que les colorations de Ziehl-Neelsen ou de Kinyoun.

Néanmoins, l’existence assez fréquente de faux positifs, notamment lorsque l’on retrouve moins de 10 BAAR sur la lame, nécessite une confirmation par une coloration de Ziehl-Neelsen.

Les frottis sont réalisés directement à partir de tous les prélèvements reçus au laboratoire et décrits précédemment.

Ils permettent de donner une indication rapide de l’infection mycobactérienne, et notamment le diagnostic rapide de patients contagieux.

Pour les prélèvements sanguins, les urines en absence de leucocyturie, ou dans le cas de prélèvements insuffisants comme les LCR, la mise en culture est privilégiée.

Le résultat est rendu de manière quantitative, en nombre de BAAR par lame, ou par champ.

En général, chez les patients non immunodéprimés, ce résultat est synonyme de tuberculose active, mais ce n’est pas le cas actuellement du fait de l’isolement croissant de mycobactéries atypiques chez les patients VIH positifs .

Le seuil de détection est de 103-104 UFC/mL.

Pour avoir une probabilité d’examen microscopique positif supérieure à 95 %, il faut au minimum 104 à 105 UFC/mL.

La sensibilité de cet examen n’est pas excellente puisque seulement 40 à 60 % des patients ayant une culture positive ont un examen microscopique positif.

Cette sensibilité varie en fait entre 22 et 80 %, en fonction du prélèvement et de la localisation de la tuberculose. Si l’on considère uniquement les prélèvements pulmonaires, cette sensibilité est de 65 %.

Ce chiffre est bien inférieur dans le cas de prélèvements extrapulmonaires, où seuls 10 à 20 % des cultures positives sont examen microscopique positif.

Il est important de noter également que le pourcentage d’examens microscopiques positifs est plus élevé pour les infections à M. tuberculosis, comparativement aux mycobactéries atypiques.

Ces éléments démontrent que cet examen est délicat, notamment sa lecture quotidienne. Une manière simple de contrôler sa réalisation correcte et son efficacité est de vérifier les frottis, conservés en double, des prélèvements positifs en culture entre 0 et 15 jours après ensemencement.

Quand on étudie la spécificité de cet examen, il est important de faire la différence entre les prélèvements contenant des mycobactéries mais qui ne sont pas retrouvés sur les milieux de culture employés, et les prélèvements dépourvus de mycobactéries.

Des discordances entre examen microscopique et culture, c’est-à-dire examen microscopique positif et culture négative (± 10 % des prélèvements), peuvent être dues :

– à des traitements en cours de patients tuberculeux, et ceci est retrouvé dans certaines études pour 66 à 95 %des examens directs faussement positifs ;

– à des problèmes de délais d’acheminement ou de traitement de l’échantillon au laboratoire affectant la survie des mycobactéries, ce qui, si cela est le cas, oblige impérativement à maintenir le prélèvement à + 4 °C ;

– ou bien à des problèmes lors de la manipulation de l’échantillon : une décontamination trop forte, l’utilisation de réactifs colorés non stériles ou reconstitués avec l’eau du robinet.

En ayant éliminé ces différents problèmes, principalement au niveau du laboratoire, par la mise en place d’un contrôle qualité, on peut considérer que la spécificité de cet examen est voisine de 100 %.

3- Diagnostic rapide par amplification génique ou PCR (polymerase chain reaction) :

La principale difficulté du diagnostic bactériologique est liée au délai parfois long du rendu du résultat à l’issue de sa réalisation, notamment l’attente du résultat de la culture pour un prélèvement à examen microscopique négatif. Toute technique mise au point dans le but de raccourcir ce délai doit être prise en compte.

De nombreux tests d’amplification génique (PCR) ont été développés principalement pour la mise en évidence d’ADN appartenant à l’espèce M. tuberculosis, utilisant des cibles différentes comme la séquence d’insertion IS6110, des gènes codant pour l’ARN 16S, ou pour différentes protéines comme la 38 kDa, la 65 kDa.

Selon les méthodes, le produit d’amplification est détecté après hybridation et révélation à l’aide d’un substrat chromogénique, ou par simple dépôt sur gel d’agarose, ou à l’issue d’une seconde amplification dans le cadre d’une PCR dite imbriquée ou nested-PCR.

L’ADN-cible peut également être capturé avant l’amplification, le but étant d’augmenter la sensibilité de la technique d’un facteur 10 à 100.

Deux tests sont commercialisés (Amplicort, Roche Diagnostics ; AMTDTt, Gen-Probe-bioMérieux), et de nombreux tests sont en développement (Strand Displacement Amplification [SDA], Becton-Dickinson ; Ligase Chain Reaction [LCx], Abbott ; Q-beta replicase Gene Track ; NAS Amplification, Organon Teknika ; Johnson and Johnson...).

Seuls les deux premiers tests ont déjà reçu l’agrément de l’Agence du médicament pour leur utilisation dans le cadre du diagnostic direct de la tuberculose.

L’utilisation de ces tests est essentiellement préconisée pour les échantillons d’origine pulmonaire du fait des études réalisées et publiées.

À tous ces tests s’ajoutent un nombre important de PCR dites « maison », développées par différentes équipes, mais dont la reproductibilité et la fiabilité n’ont pas été évaluées en dehors du laboratoire ayant réalisé la mise au point.

* Description des tests commercialisés :

Le test AMTDTt (Gen-Probe), commercialisé par bioMérieux, repose sur la détection et l’amplification de l’ARN ribosomal 16S spécifique des espèces appartenant au complexe M. tuberculosis, après une étape de transcription en ADNc à l’aide d’une reverse transcriptase.

L’ADNc est ensuite détecté par hybridation avec une sonde complémentaire conjuguée à un marqueur chimioluminescent.

Il pourrait présenter un intérêt supplémentaire dans le cadre de suivi thérapeutique du fait de la détection d’ARN, présent uniquement lorsque les bactéries sont viables.

Le testAmplicort, commercialisé par Roche Diagnostics, est un test qualitatif permettant de déceler la présence d’ADN mycobactérien dans les échantillons cliniques.

Le kit comprend un contrôle interne et l’utilisation d’uracile-Nglycosylase validant l’interprétation finale de la réaction d’amplification. L’ADN polymérase amplifie une partie spécifique du gène codant pour l’ARN 16S.

L’utilisation d’amorces biotinylées permet de marquer l’ADN amplifié.Après hybridation à une sonde spécifique, le complexe est révélé par une réaction enzymatique.

Le contrôle interne, systématiquement utilisé, permet la détection d’inhibiteurs de l’amplification.

Une automatisation de la technique est en cours d’agrément (Cobas Amplicor), avec deux sondes supplémentaires pour détecter M. avium et M. intracellulare.

Cet appareil permet de réduire considérablement le temps imparti à cette technique, ainsi que les risques de contamination croisée lors des manipulations suivant l’amplification.

* Sensibilité et spécificité des tests d’amplification génique :

Sans entrer dans les comparaisons entre chaque test, principalement du fait qu’il existe très peu d’études comparatives sur les mêmes échantillons effectuées en routine, plusieurs problèmes sont couramment observés, quels que soient les tests utilisés :

– la faible sensibilité dans le cas de prélèvements à examen microscopique négatif (faux négatifs) ;

– la présence de faux positifs ;

– la présence d’inhibiteurs de la réaction d’amplification.

En présence de prélèvements ayant un examen microscopique positif, la sensibilité est toujours voisine ou supérieure à 95 % pour une spécificité de 98-99 %.

Mais lors de prélèvements ayant un examen microscopique négatif, cette sensibilité varie entre 40 et 77 %.

On constate également que les études ont comparé la PCR à la culture comme élément de référence positif, mais il faut se souvenir que 20 à 25 % des patients tuberculeux sont traités sans documentation bactériologique ou histologique.

L’approche clinique n’a pas été réalisée, et on constate donc, notamment pour les examens microscopiques négatifs, que les valeurs prédictives positive et négative d’un tel test varieront fortement en fonction du degré de suspicion de tuberculose pour un même patient.

Des études interlaboratoires ont également démontré une absence de fiabilité de la méthode.

Selon la technique employée, les laboratoires étaient incapables de détecter un nombre faible d’organismes et présentaient des taux de faux positifs élevés, comme cela peut exister pour les cultures.

Il faut souligner que dans les études réalisées, il n’était pas mis en évidence de lien entre les techniques utilisées et les résultats obtenus, mais que les laboratoires qui présentaient les meilleurs résultats utilisaient une technique d’hybridation après amplification, comme cela est préconisé pour les tests commercialisés.

Du fait de leur coût, comparativement à un examen direct, ces tests doivent être utilisés selon une stratégie précise.

Les arguments principaux en faveur d’une telle approche sont la prise en charge efficace des patients ainsi que le contrôle potentiel de la transmission de l’infection.

On voit ici que l’amplification génique ne pourra répondre en l’état actuel des études sur la contagiosité d’un patient, alors que l’examen microscopique le signalera.

L’autre question est de savoir si la positivité d’une PCR entraînera ou non la mise sous traitement du patient, connaissant l’existence des résultats faussement positifs pour ce test.

Notre approche au laboratoire consiste à réaliser une PCR systématiquement sur tout prélèvement avec examen microscopique positif, de manière à informer rapidement le clinicien de l’identification de la mycobactérie responsable de l’infection.

Cela permettra à celui-ci, en cas de PCR négative sur un prélèvement avec examen microscopique positif, et connaissant la sensibilité de la PCR dans ce cas précis, d’attendre le résultat de la culture avant de mettre son patient sous traitement antituberculeux.

Ou alors, chez un patient VIH positif, cela lui permettra de suspecter une infection due à une mycobactérie non tuberculeuse et d’adapter son traitement en fonction des mycobactéries couramment retrouvées chez les patients VIH positifs.

Par opposition, une discussion sera engagée entre le clinicien et le laboratoire pour réaliser une PCR sur un prélèvement avec examen microscopique négatif, de manière à expliquer que, du fait de la faible sensibilité de ce test dans cette situation, un résultat négatif n’exclut pas le diagnostic de tuberculose.

L’amélioration des tests d’amplification devrait être réalisée dans quatre directions.

Il apparaît essentiel d’obtenir une sensibilité suffisante dans les formes pulmonaires avec examen microscopique négatif.

Il faut améliorer sa valeur diagnostique sur les prélèvements extrapulmonaires et dans les formes paucibacillaires, pédiatriques, dans les méningites.

Il serait enfin intéressant de connaître la relation entre la positivité de la PCR et l’infectiosité des sujets, et de déterminer son intérêt dans le cadre du suivi thérapeutique.

C - Conditions de culture et identification au laboratoire :

Le diagnostic de certitude de la tuberculose, et des mycobactérioses en général, repose sur l’isolement et l’identification de l’agent étiologique.

Le rendement de la culture de M. tuberculosis dans les produits pathologiques est supérieur à celui de l’examen microscopique, puisque l’on obtient presque deux fois plus de résultats positifs avec la culture comparativement au seul examen microscopique.

La répétition des cultures permet d’augmenter la proportion de résultats positifs.

Devant l’importance de ce diagnostic, les laboratoires doivent reconnaître l’urgence et être à même d’optimiser les procédures, ainsi que les délais de rendu des résultats au clinicien.

Nous verrons au cours de ce chapitre que les moyens pour raccourcir ces délais sont à notre disposition et, en comparant les différentes méthodes, quels choix devront être effectués.

1- Milieux de culture utilisés :

M. tuberculosis, ainsi que la majorité des mycobactéries atypiques pathogènes, ne se cultivent pas sur les milieux usuels de bactériologie, à l’exception de M. fortuitum et de M. marinum.

Des milieux riches ont été définis, développés, mais seul un petit nombre est utilisé en pratique courante.

On distingue les milieux solides à l’oeuf, les milieux gélosés semisynthétiques et les milieux liquides.

* Milieux solides à l’oeuf :

Le milieu de Löwenstein-Jensen (LJ), contenant des sels minéraux, de l’asparagine, de la glycérine, du vert malachite (antiseptique) et de l’oeuf, est le milieu le plus couramment employé.

Il présente plusieurs avantages : une bonne sensibilité, un prix de revient faible, et donne un aspect caractéristique aux colonies.

Mais sa préparation est délicate, longue, sa durée de conservation courte et sa reproductibilité liée à la qualité des produits employés.

Le milieu de Coletsos, dérivé du milieu de LJ et contenant 0,3-0,4 % de pyruvate de sodium est également employé car il favorise la croissance de M. africanum et M. bovis.

L’aspect, ainsi que le délai d’apparition des colonies, varient pour les mycobactéries appartenant au complexe tuberculosis, et de manière similaire pour les mycobactéries atypiques.

Les mycobactéries comme M. marinum, M. ulcerans, M. chelonae, M. haemophilum devront être incubées entre 25 et 30 °C.

* Milieux gélosés semi-synthétiques :

Ces milieux, développés par Middlebrook, présentent une meilleure sensibilité comparativement aux milieux à l’oeuf.

Ils contiennent de nombreux sels minéraux, du glucose, la fraction V de l’albumine bovine, des acides aminés, du pyruvate de sodium...

Ils sont incubés en présence de CO2.

Ces milieux sont parfaitement transparents et permettent donc un dépistage précoce des colonies, ce qui améliore la sensibilité.

Mais ces milieux ont un prix de revient élevé et leur durée de vie est courte.

L’exposition à la lumière et à la chaleur entraîne l’apparition de formaldéhyde toxique pour les mycobactéries.

* Milieux liquides :

Plusieurs milieux, soit liquide (monophasique) : Bactec 12B, milieu 13A, MGIT (Mycobacteria growth indicator tube), Bactec 9000 MB (Becton Dickinson), MB/BacT (Organon), ESP Myco (Difco), soit liquide et solide (biphasique, avec ensemencement régulier) : MB Check (Roche-Boehringer), Septi-Check AFB (Becton Dickinson), ont été développés ces dernières années.

Ils permettent la mesure de la croissance bactérienne par différentes techniques grâce à une source radioactive, une source fluorimétrique ou colorimétrique, un dégagement ou une consommation de gaz.

Le Bactec 12B, adapté à une détection automatisée (Bactec 460 TB, Becton Dickinson), a été développé par Middlebrook en 1977.

Il contient comme source unique de carbone de l’acide palmitique marqué au 14C qui, après consommation, donnera du 14CO2.

L’appareil mesure le dégagement de 14CO2 et le traduit en index de croissance.

La majorité des mycobactéries pathogènes et opportunistes sont détectées avec ce milieu et dans des délais plus courts que les milieux solides, à condition pour certaines mycobactéries de penser à incuber ce milieu à la température adéquate.

Il possède malgré tout plusieurs inconvénients majeurs : l’utilisation d’une source radioactive, entraînant des problèmes quant à l’utilisation et l’élimination de ces produits ; la nécessité d’ensemencer à l’aide d’une seringue pouvant être responsable d’accidents par piqûre septique pour le personnel technique, et l’existence de contaminations croisées par défaillance du système de stérilisation de l’aiguille permettant de mesurer la production de 14CO2.

Certains inconvénients, inhérents à tous les milieux liquides, sont également cités comme l’absence de visualisation des colonies, bien que l’examen microscopique des cultures de M. tuberculosis (aspect en cordes) soit caractéristique ; ainsi que la mise en évidence d’infections mixtes, le taux de contamination et le coût.

Un nouveau milieu a été récemment développé, le milieu MGIT (Becton Dickinson), pour permettre de pallier ces inconvénients : une source fluorimétrique pour la détection de la croissance, un tube à vis évitant l’ensemencement à la seringue, et surtout une lecture en continu automatisée à l’aide d’un appareil, le Bactec 960 TB, ce qui évite le chargement journalier réalisé sur le Bactec 460 TB.

De manière similaire, Organon a adapté son milieu liquide pour hémocultures pour l’utiliser dans le cadre du diagnostic bactériologique des mycobactéries.

Le principal inconvénient réside dans la taille des flacons, obligeant à utiliser des incubateurs de taille conséquente.

La détection de la croissance s’effectue par une mesure colorimétrique de la quantité de CO2 dissous dans le milieu de culture, grâce à un indicateur coloré et un réflectomètre, et se fait en continu par un automate.

Le système ESP II Myco développé par Difco est récent.

Il mesure la quantité de gaz dégagé ou consommé et relie cette mesure à un index de croissance.

Enfin, des milieux biphasiques (MB Check, Roche) ont été utilisés.

Ils présentent de nombreux avantages, car ils associent la sensibilité du milieu liquide, la possibilité de visualiser les colonies et de différencier rapidement les mycobactéries complexes tuberculosis des mycobactéries atypiques par l’utilisation d’une gélose sélective.

Dans chaque milieu liquide est ajouté un supplément de croissance et un cocktail antibiotique (polymyxine, acide nalidixique, ± vancomycine, ± azlocilline et amphotéricine B), généralement destiné à limiter la croissance des bactéries usuelles et des levures non tuées à l’issue de la décontamination.

2- Identification des mycobactéries :

L’aspect principal de l’identification est de différencier les mycobactéries du complexe tuberculosis des mycobactéries atypiques.

Avec l’évolution des techniques de biologie moléculaire, un choix peut être fait entre ces techniques et les méthodes dites traditionnelles ou biochimiques.

Un argument non négligeable pour fixer ce choix sera le délai de rendu du résultat.

* Coloration de Ziehl-Neelsen :

Il est impératif sur toute culture positive, qu’elle soit liquide ou solide, de réaliser une coloration de Ziehl-Neelsen pour vérifier la présence de BAAR et exclure l’existence de contaminants.

Comme cela a été précédemment évoqué, les mycobactéries ont un aspect caractéristique, avec une bonne corrélation entre cet examen microscopique et les résultats des tests biochimiques et de l’hybridation moléculaire.

Cela est très utile pour l’orientation des tests à utiliser pour une identification.

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