Facteurs rhumatoïdes et marqueurs de la polyarthrite rhumatoïde (PR de l’adulte) :

A - FACTEURS RHUMATOÏDES :

Les facteurs rhumatoïdes (FR) sont des (auto)anticorps antifragment constant (Fc) des immunoglobulines G (IgG).

En clinique, on s’intéresse surtout aux FR d’isotype IgM, mais il existe également des FR d’isotype IgA, IgG ou IgE.

1- Détection :

Les FR IgM ont initialement été mis en évidence par des réactions d’agglutination : hémagglutination de globules rouges sensibilisés par des anticorps (IgG) et agglutination de particules de latex sensibilisées par des gammaglobulines humaines agrégées par la chaleur (test du latex).

La réaction de Waaler-Rose, pratiquée par les Anglo-Saxons, utilise des globules rouges de mouton sensibilisés par des anticorps IgG de lapin.

En France, Eyquem et Podliachouk ont modifié la technique en utilisant des globules rouges humains Rhésus O négatif sensibilisés par des IgG de lapin antihématies humaines.

Le dépistage peut se faire sur lame et le dosage en tube. Les seuils de positivité retenus sont le 1/64e pour la réaction de Waaler-Rose et le 1/80e pour le test au latex.

Les résultats sont exprimés en unités internationales grâce aux sérums de références fournis par la Croix rouge ou l’Organisation mondiale de la santé (OMS).

Le test du latex est automatisable et la néphélométrie laser permet des dépistages de masse.

Des techniques Elisa sont également disponibles pour les FR IgM, mais aussi IgA et parfois IgG, bien que pour ces derniers, il persiste des faux positifs selon les trousses commerciales disponibles.

Le gain de sensibilité est faible parfois aux dépens de la spécificité.

2- Signification diagnostique des facteurs rhumatoïdes :

Les facteurs rhumatoïdes IgM sont présents dans 70 % des PR évoluant depuis plus de 1 an.

Cette fréquence ne serait que de 50 à 60 % dans les polyarthrites débutantes.

L’apparition du FR précède fréquemment les signes cliniques, 45 % des cas dans une série scandinave, parfois de plusieurs années.

La spécificité des FR IgM anti-IgG est médiocre puisqu’ils sont souvent rencontrés au cours des autres connectivites, des hépatopathies, des lymphopathies malignes, et même lors de maladies infectieuses.

La valeur pronostique défavorable des facteurs rhumatoïdes IgM agglutinants est reconnue depuis longtemps, tant pour le pronostic fonctionnel et radiologique articulaire à court et à long terme que pour leur association aux manifestations extra-articulaires.

B - ANTICORPS ANTIFILAGGRINE ET PROTÉINES CITRULLINÉES :

Il s’agit d’une famille d’autoanticorps reconnaissant des motifs antigéniques riches en citrulline.

Cet acide aminé résulte d’une modification post-traductionnelle de 20 % des arginines en citrulline par l’action d’une peptidylarginine déiminase.

Différentes protéines subissent une telle transformation enzymatique, en particulier les protéines des épidermes ou muqueuses kératinisées riches en filaggrine, protéine filamenteuse absente du milieu synovial.

D’autres protéines présentes dans la membrane synoviale subissent aussi cette citrullination : la fibrine et la vimentine en seraient deux exemples parmi d’autres.

Historiquement, ces anticorps anticitrulline ont été mis en évidence par immunofluorescence indirecte sur des substrats épithéliaux.

1- Anticorps antipérinucléaires :

Il s’agit d’anticorps habituellement de type IgG, dirigés contre des granules sphériques de kératohyaline de 0,5 à 4 µmprésents dans le cytoplasme des cellules de la muqueuse buccale humaine.

Le substrat utilisé pour la détection des anticorps antipérinucléaires (APN) constitue l’élément limitant la diffusion de ce test diagnostique.

En effet, il est nécessaire d’utiliser extemporanément les cellules de l’épithélium buccal humain provenant de « bons » donneurs.

En termes de sensibilité, les résultats de la littérature s’échelonnent entre 20 et 91 %.

La fréquence des APN au cours de la PR séronégative varie selon les séries de 4 à 52%.

Dans les petites séries de PR débutantes, sans FR, les chiffres varient de 17 à 35 %.

Compte tenu du caractère très hétérogène des groupes étudiés, les chiffres de spécificité varient d’une série à l’autre, de 73 à 99 %.

Parmi les autres affections rhumatologiques pouvant s’accompagner d’APN, il faut mentionner le syndrome de Gougerot-Sjögren primaire (20 %) et accessoirement le lupus (15 %) et l’arthrite psoriasique (13 %) dans sa forme périphérique polyarticulaire.

Les APN apparaissent très précocement et peuvent ainsi servir de marqueur biologique précoce de l’affection.

Tout comme les FR, les APN peuvent être détectés en phase préclinique de la PR chez 20 % des futurs malades.

La présence d’APN est corrélée à la sévérité de la maladie.

Des auteurs néerlandais ont souligné que les polyarthrites séronégatives avec APN avaient un score de gravité plus élevé, et un pronostic moins favorable que les PR séronégatives sans APN.

Le groupe human leucocyte antigen (HLA) DR4 (DRB1*0401, 0404, 0405) est significativement plus fréquent dans les PR avec APN.

2- Anticorps antikératine :

Les anticorps antikératine (AAK), ou mieux anti-stratum corneum, sont des autoanticorps de type IgG dirigés contre une protéine filamenteuse des couches superficielles des épidermes kératinisés.

Leur mise en évidence s’est faite jusqu’à présent par immunofluorescence indirecte sur coupe du tiers inférieur d’oesophage de rat.

Ces anticorps sont présents dans 36 à 57 % des PR avec FR IgM anti-IgG, et dans 6 à 40% des PR sans FR décelable par les tests au latex et de Waaler-Rose.

Les AAK sont très spécifiques (95 à 100 %) de la PR de l’adulte. Ils sont présents dès la première année d’évolution chez 40 % de nos malades.

Parmi les PR débutantes sans FR, les chiffres tombent entre 12 et 24 %.

Ils semblent devoir être présents dès la phase préclinique de la PR chez 20 % des futurs malades.

Leur valeur pronostique défavorable sur les destructions articulaires n’est pas admise par tous les auteurs.

Leur association à une plus grande évolutivité est, elle, admise.

3- Anticorps antifilaggrine et antipeptides cycliques citrullinés :

La filaggrine est une protéine filamenteuse associée aux cytokératines.

C’est la cible principale des APN et AAK.

Des dosages spécifiques des antifilaggrines (AFA) ont donc été proposés à partir de la protéine purifiée par western blot (WB) et par Elisa.

La fréquence des AFA est de 54 % en Elisa et 60 % en WB dans les PR anciennes et entre 50 et 30 % pour les PR débutantes.

Cependant, parmi les PR débutantes sans FR, les chiffres tombent entre 8 et 27 % pour l’Elisa et 13 % pour le WB.

Un Elisa antipeptides cycliques citrullinés (CCP) a été mis au point pour doser ces anticorps.

Ce test est positif chez 75 % des PR anciennes et chez 50 à 60 % des PR débutantes.

Parmi ces PR débutantes, les PR sans FR ont des anti-CCP en Elisa dans 17 à 43 % des cas selon les séries (35 % en moyenne).

C - ANTICORPS ANTI-SA :

Ces anticorps sont détectés par immunoempreinte à partir d’un extrait de rate ou de placenta humains.

L’antigène migre à un poids moléculaire apparent de 50 kD.

Les anticorps de type IgG anti-Sa sont présents dans 43 % des PR, plus souvent parmi les polyarthrites avec FR (50 %) que dans les polyarthrites sans FR (27 %).

Ils semblent présents dès le début clinique de la maladie (20 % des PR ayant moins de 1 an d’évolution), et notamment chez 15 à 28 % de PR sans FR.

La protéine

Sa pourrait également appartenir à la famille des protéines déiminées en citrulline.

Il pourrait s’agir de la vimentine, ou alors la protéine Sa serait intimement liée à la vimentine, ou de l’alphaénolase.

La valeur pronostique des anti-Sa reste discutée, certains auteurs ayant rapporté leur présence dans 68 % des PR avec de fortes destructions articulaires, contre 22 % pour les PR sans destruction.

D’autres études sont nécessaires pour conclure.

La nature et la fonction de la protéine Sa sont encore discutées.

D - AUTRES MARQUEURS DE LA POLYARTHRITE RHUMATOÏDE DE L’ADULTE :

1- Anticorps anti-RA 33 :

Il s’agit d’autoanticorps antinucléaires non détectables par immunofluorescence indirecte, mis en évidence par des réactions d’immunoempreinte à partir d’un extrait nucléaire très riche en protéines.

Les anticorps IgG anti-RA 33 sont présents dans le sérum de 35 % des PR vues en France, qu’elles comportent ou non la présence du FR IgM anti-IgG.

Les anti-RA 33 sont présents dès le début clinique de la PR, dans 15 à 28 % des PR débutantes sans FR.

La spécificité des anti-RA 33 n’est que de 85 %, détectée dans 50 à 60 % des connectivites mixtes, 25 % des lupus érythémateux disséminés de l’adulte ou de l’enfant.

La cible antigénique des anti-RA 33 est la protéine A2 liée au hnRNA.

2- Anticorps anticalpastatine :

La calpastatine est une protéine inhibitrice naturelle d’enzymes protéolytiques, les calpaïnes.

La molécule de calpastatine est antigénique et les épitopes principaux reconnus par les autoanticorps sont situés sur la partie C-terminale de la molécule.

À partir de protéines de fusion, il est possible de doser les autoanticorps anticalpastatine par western blot ou Elisa.

Ainsi des anticorps anti-RA-6 (calpastatine) sont détectés chez 57 % de PR anciennes par WB et des anti-RA-1 sont détectés en Elisa chez 33 % des PR débutantes, 28 % des PR débutantes sans FR.

La spécificité de ces anticorps est mauvaise (71 % en WB), en particulier le test Elisa est positif chez 37 % des rhumatismes inflammatoires débutants non PR.

Ces anticorps n’ont donc pas de valeur diagnostique par les méthodes de dosage actuellement proposées.

3- Immunoglobulines G agalactosylées :

Il existe au cours de la PR, dans les lymphocytes B, un déficit enzymatique en galactosyl-transférase.

Environ 85 % des PR de l’adulte sont accompagnées d’un taux augmenté d’IgG agalactosylées.

Cette anomalie n’est pas spécifique à la PR de l’adulte.

Elle est cependant précoce puisqu’elle est retrouvée dans 77 % des cas d’une série de 39 PR vues durant leur première année d’évolution. Ce déficit est cependant rarement isolé : il représente 8 % des PR sans FR IgM anti-IgG évoluant depuis moins de 1 an.

Il pourrait là aussi s’agir d’un marqueur précoce des polyarthrites érosives et évolutives.

En fait, très peu de séries de rhumatismes inflammatoires débutants ont mis en oeuvre l’ensemble des tests immunologiques diagnostiques d’une PR débutante.

La série du NIH aux États-Unis a permis de comparer sept tests différents.

En pratique, le clinicien doit s’appuyer pour le diagnostic biologique de PR de l’adulte sur l’association de deux tests : un test dosant les facteurs rhumatoïdes IgM (test du latex ou néphélométrie laser ou Elisa) et un test explorant les anticorps antifilaggrine (antipérinuclaires en immunofluorescence ou antipeptides cycliques citrullinés ou antifilaggrine citrullinée en Elisa).

Cette combinaison permet une spécificité de 98 % pour une sensibilité de 80 % pour l’un des deux tests (et 60 % pour les deux tests simultanément).

Anticorps antinucléaires :

Les anticorps antinucléaires (AAN) sont des autoanticorps non spécifiques d’organe.

Les antigènes cibles sont extrêmement nombreux et sont constitués habituellement de polypeptides hétéromultimériques liés fréquemment à un acide nucléique : ADN ou acide ribonucléique (ARN) de petit ou de haut poids moléculaire.

Il en est ainsi des nucléosomes formés d’ADN natif et d’histones, des sn RNPs formés de polypeptides et d’ARN riche en uridine, des hYRNPs formés de polypeptides liés aux hYARN. Plus rarement, des déterminants antigéniques sont situés, non sur les protéines, mais sur un acide nucléique.

Détectés au cours de la maladie lupique (facteur sérique de Haserick responsable de la formation de cellules LE), les anticorps antinoyau sont en fait des marqueurs de très nombreuses connectivites où prédominent certaines spécificités qui en font des outils utiles au diagnostic.

Mais nombre d’autres affections peuvent comporter de façon transitoire (viroses) ou permanente (hépatopathies, hémopathies, parasitoses chroniques, etc) des anticorps antinucléaires.

La stratégie en cascade est préconisée pour le dépistage puis la caractérisation des AAN.

A - DÉPISTAGE DES ANTICORPS ANTINOYAU :

Il s’effectue sur des frottis d’une lignée de cellules tumorales humaines immortalisées provenant d’un carcinome laryngé : les cellules HEp-2.

La méthode de dépistage universellement utilisée est l’immunofluorescence indirecte.

De très nombreux aspects de la fluorescence peuvent être observés qui orientent parfois vers une spécificité antigénique particulière.

Ainsi, grossièrement, on distingue les aspects :

– homogènes : devant faire rechercher des anticorps anti-ADN natif, mais aussi des antihistones et/ou des antinucléosomes ;

– membranaires ou cerclé évoquant des anti-ADN natifs mais aussi des antilaminines ;

– nucléolaires exclusifs dont on peut distinguer plusieurs aspects (en mottes, en grains, …) correspondant à des anti-Pm/Scl, anti- Th/To, antifibrillarine ou anti-U3RNP, …;

– mouchetés devant faire évoquer la présence d’anticorps antiantigènes nucléaires solubles (Sm, U1RNP, SSA/Ro, SSB/La, …) ;

– en taches multiples plus ou moins fines dont une des spécificités correspond à des anticorps anticentromère.

L’utilisation des cellules HEp-2 permet également de dépister des anticorps dirigés contre des constituants cytoplasmiques parfois associés aux connectivites : ribosomes, tARN synthétases, mitochondries, appareil de Golgi…

Le rendu du dépistage des AAN doit comporter, non seulement l’aspect de la fluorescence, mais également le titre des anticorps.

Ainsi, sur HEp-2, seuls les taux supérieurs ou égaux à 1/160e ont une valeur pathologique.

En effet, nombre de sujets normaux, plus souvent âgés de plus de 65 ans, ont des taux de 1/80e, voire de 1/160e.

B - PRINCIPAUX ANTICORPS ANTINUCLÉAIRES ASSOCIÉS AUX GRANDES CONNECTIVITES :

1- Anticorps antinucléaires associés au lupus érythémateux systémique :

* Cellules LE ou cellules de Hargraves :

La recherche de cellules LE, positive chez 60 à 90 % des lupus, ne figure plus parmi les critères 1982, révisés en 1997, de l’association des rhumatologues américains (ARA). Les anticorps responsables sont des antihistones H1.

Les cellules LE ne sont pas spécifiques du LES.

Cet examen ne se pratique plus.

* Anticorps anti-ADN :

Seuls les anticorps anti-ADN natifs sont spécifiques du LES.

Trois techniques sont actuellement utilisées pour doser les anticorps anti- ADN natifs :

– test de Farr : c’est une méthode radio-isotopique de référence (« gold standard ») en cas de résultat discordant avec les autres techniques.

La spécificité au test de Farr est excellente.

Les principales séries font état de 80 à 98 % de tests positifs avec une bonne corrélation globale (mais pas toujours individuelle) entre taux de fixation et activité clinique de la maladie lupique, en particulier l’existence d’une néphropathie ;

– test d’immunofluorescence indirecte sur kinétoplaste de Crithidia luciliae : nous considérons l’immunofluorescence indirecte sur Crithidia luciliae comme une méthode sensible de dépistage, quoique peu spécifique pour les titres faibles, en sachant qu’il existe des dissociations avec le test radio-immunologique dans 20 % des cas dans les deux sens ;

– tests Elisa : ils permettent de déterminer la classe, voire la sousclasse des anticorps anti-ADN et leur capacité à fixer le complément.

Seuls les taux élevés d’isotype IgG isolé ou associé à des IgM sont spécifiques du lupus.

* Anticorps antinucléosomes :

On a pu mettre en évidence dans le lupus spontané des autoanticorps reconnaissant de façon exclusive des motifs des nucléosomes.

Le nucléosome est la sous-unité élémentaire de la chromatine.

Il s’agit d’un complexe plurimoléculaire constitué d’un corps protéique formé de l’association de quatre paires d’histones H2A-H2B, H3 et H4, protéines basiques autours desquelles s’enroule un ADN double brin (natif) d’une longueur moyenne de 146 paires de bases formant deux tours de spire, l’ensemble étant rendu cohérent par l’histone H1 qui sert d’écarteur entre deux paires de nucléosomes.

Par méthode Elisa, on montre que les anticorps anti- ADN sont capables de fixer les nucléosomes.

Il en est de même des antihistones H1 et H2B qui reconnaissent les épitopes situés sur la partie externe (accessible aux anticorps), à la surface des nucléosomes.

Il est démontré que les anti-ADN et les antihistones ne contribuent que pour 30 % à l’activité antinucléosome et que pour 70 %, il s’agit d’anticorps spécifiques des nucléosomes.

Plusieurs séries sont désormais disponibles qui ont étudié la signification clinique des anticorps antinucléosomes à partir de trousses commerciales aisément disponibles.

Ainsi les IgG antinucléosomes ont été mises en évidence chez les lupus systémiques dans 56 à 85 % des cas, voire plus en période évolutive (100 %), mais aussi dans d’autres connectivites telle que la sclérodermie systémique (5 à 46 % des cas) et la connectivite mixte (20 à 45 % des cas), deux affections ne comportant pas d’anticorps anti-ADN natif.

On peut conclure ainsi à une forte sensibilité des antinucléosomes au cours du lupus, ces anticorps persistant souvent lorsque le lupus est inactif (62 %) ou lorsqu’il n’y a pas ou plus d’anti-ADN natif (10 à 30 %).

La spécificité calculée varie de 94 à 97 % selon les séries.

* Anticorps antihistones :

Les anticorps antihistones sont désormais détectés par test Elisa global mettant en évidence des anticorps reconnaissant l’ensemble des histones, principalement les protéines H2A, H2B, H3, H4, …

Leur intérêt tient à leur fréquence au cours des lupus induits médicamenteux (90 %), mais ils ne sont pas spécifiques (65 % de positifs dans le lupus systémique spontané).

Les médicaments les plus récents à l’origine d’un lupus induit entraînent fréquemment la production d’anti-ADN natif : minocycline, IFNa, anti-TNFa…)

* Anticorps spécifiques d’antigènes nucléaires solubles :

Les antigènes nucléaires solubles sont soit des URNPs, soit des hYRNPs.

Les URNPs sont constitués de différents UARN nucléaires (U1, U2, U4…) et de protéines antigéniques liées (68kD liée au seul U1RNP, protéines A, B, B’, B², C et D).

Les hYARN sont faits de petits ARN (hY1, Y2, Y3, …) liés à des polypeptides telle la protéine Ro 60 kD elle-même associée à Ro 52 kD ou La 48 kD.

Ils siègent dans le noyau, mais aussi dans le cytoplasme des cellules.

– anti-Sm et U1-RNP : l’incidence des anticorps anti-Sm reconnaissant la protéine D des URNPs au cours des LES est variable selon l’origine ethnique des malades : les chiffres de 30 % proposés dans les séries nord-américaines avec les tests de précipitation en gélose sont très différents des chiffres de 3 à 7 % trouvés dans les séries européennes caucasiennes, mais plus proches de ceux observés chez les Noirs antillais, les Maghrébins ou les Orientaux.

Les méthodes plus sensibles comme l’Elisa donnent des prévalences beaucoup plus élevées d’anti-Sm et anti-U1-RNP : 52 % chez les Noirs, 19 % chez les Latino-Américains pour les anti-Sm, 66 et 32 % pour les anti-U1-RNP.

La spécificité des anti-Sm est excellente au point d’avoir été incluse dans les critères 1982 de ARA pour le diagnostic de lupus.

Les anticorps anti-U1-RNP ne sont pas spécifiques du lupus ; ils sont présents chez 30 à 40 % des maladies lupiques.

Ces anticorps reconnaissant plus spécialement la protéine 68kD liée à l’U1ARN, mais aussi les protéines A et C liées à tous les U-ARN.

– anticorps anti-SSA/Ro et SSB/La : l’Elisa est actuellement la méthode de choix.

Les fréquences d’anti-Ro (SSA) sont de 61 % chez les Afro-Américains et 30 % chez les Latino-Américains, celles d’anti-La (SSB) de 20 et 18 %.

Les anti-SSA/Ro sont très peu spécifiques.

Les anti-SSA/Ro reconnaissent, soit la protéine Ro 60kD, soit la protéine Ro 52kD.

Les deux types d’anticorps sont habituellement associés chez un même malade atteint de lupus.

* Anticorps antiribosomes :

Recherchés par Elisa, les anticorps antiprotéine Po ribosomale sont présents chez 20 % des LES.

Ils sont exceptionnellement isolés, et s’associent volontiers à des anti-antigènes nucléaires solubles et aux anti-ADN natifs.

L’intérêt principal de ces antiribosomes serait d’accompagner les lupus avec localisation neurologique centrale de type dépression.

En fait, on les observe souvent en cas d’atteinte rénale sévère.

2- Anticorps antinucléaires associés aux sclérodermies systémiques :

Les marqueurs des sclérodermies systémiques sont dominés par les anticorps antinucléaires.

La présence d’anticorps antinucléaires en immunofluorescence indirecte est presque constante dans les séries de la littérature.

Certaines spécificités sont très particulières aux sclérodermies et constituent des outils diagnostiques très précieux pour le clinicien.

Leur intérêt pronostique est également démontré.

* Anticorps anticentromère :

Ils sont dépistés très facilement par immunofluorescence indirecte sur frottis de cellules HEp-2, montrant une fluorescence en petite taches correspondant aux centromères des chromosomes et se disposant en plaque équatoriale sur les cellules en mitose.

Il existe désormais des trousses commerciales Elisa permettant de doser les anticorps anticentromère reconnaissant la protéine B du centromère.

Ce test de confirmation n’est absolument pas nécessaire pour la routine.

Les anticorps anticentromère ne sont pas totalement spécifiques de la sclérodermie limitée.

Ils se rencontrent avec des fréquences inférieures à 5 % dans d’autres connectivites : surtout dans le syndrome de Gougerot-Sjögren, et accessoirement dans la PR (moins de 1 %).

* Anticorps antitopo-isomérase I (Scl70) :

Ils sont détectés, soit par précipitation en gélose (méthode d’Ouchterlony), et identifiés à l’aide de sérums de référence, soit par des trousses commerciales Elisa, utilisant la protéine topo-Iisomérase recombinante, soit enfin par des méthodes de dot-blot pour lesquelles il existe également des trousses commercialisées.

La spécificité des anticorps antitopo-isomérase est de l’ordre de 100 % pour la sclérodermie systémique, lorsqu’ils sont recherchés par précipitation en gélose.

* Anticorps anti-U1-RNP :

Outre ces deux grands anticorps, d’autres spécificités ont été caractérisées, certaines d’entre elles étant faciles à mettre en évidence dans un laboratoire de routine.

Ainsi, les anticorps anti-U1-RNP peuvent être présents chez 15 à 30 % des malades sclérodermiques selon les ethnies.

Il s’agit du même anticorps que celui rencontré au cours des connectivites mixtes dont l’évolution peut se faire vers une connectivite majeure, telle une sclérodermie systémique.

* Anticorps antinucléolaires :

Environ 20 % des sclérodermies systémiques ont un aspect nucléolaire de la fluorescence correspondant à diverses spécificités antigéniques.

Ces anticorps se rencontrent volontiers dans les tableaux de syndrome de chevauchement, entre sclérodermie et polymyosite.

La méthode pour la caractérisation des différentes spécificités relève de laboratoires hautement spécialisés utilisant des techniques d’immunoprécipitation d’antigènes radiomarqués.

Parmi ces spécificités, citons les anticorps anti-U3-RNP dirigés contre le constituant protéique de 34 kDa, la fibrillarine (4 % des sclérodermies systémiques), les anticorps anti-Th/To protéine de la ribonucléoprotéine 7.2 RNP (2 à 4 % des malades), le NOR-90 (région organisatrice du nucléole), le PmSCL (20 % des syndromes de chevauchement polymyosite/sclérodermie), les anti-ARN polymérase I (20 % des malades atteints de sclérodermie).

* Anticorps anti-ARN polymérase de type II :

Ils produisent une fluorescence de type homogène sur frottis cellulaires.

Détectés aussi par des méthodes d’immunoprécipitation d’antigènes radiomarqués, ils seraient présents chez 58 % des patients ayant une sclérodermie systémique diffuse, et seulement 6 % des patients ayant une sclérodermie localisée bénigne.

Ces anticorps auraient donc une forte valeur pronostique, et peuvent coexister avec des anticorps anti-topo-isomérase I (ou Scl70).

La mise au point, dans un proche avenir, d’une méthode de dosage Elisa facilitera leur détection en routine. Les anticorps anticentromère sont présents chez 50 à 80 % des patients ayant une atteinte cutanée limitée, de bon pronostic en terme de survie, incluant les patients ayant un syndrome CREST.

Au contraire, les anticorps antitopo-isomérase I, autrefois appelés anti-Scl 70, présents chez 20 à 40 % des patients atteints de sclérodermie diffuse sont associés à des courbes actuarielles de survie beaucoup plus préoccupantes.

Ces deux anticorps sont habituellement mutuellement exclusifs.

De même les anticorps anti- ARN polymérase II sont associés avec les formes les plus sévères de sclérodermie systémique (atteintes rénales et pulmonaires).

3- Anticorps antinucléaires associés à la connectivite mixte ou syndrome de Sharp :

Cette affection est caractérisée au plan biologique par un titre élevé d’anticorps antinucléaires en immunofluorescence indirecte d’aspect moucheté, avec présence d’anticorps anti-U1-RNP et plus particulièrement contre les protéines 68 kD, A (30 kD) et C (18 kD) du complexe U1-RNP.

On dispose actuellement de tests Elisa utilisant des protéines recombinantes ou purifiées pour la caractérisation de ces anticorps.

La présence d’anti-U1-RNP est nécessaire (mais non suffisante) pour porter le diagnostic de connectivite mixte.

4- Anticorps antinucléaires et anticytoplasme associés aux poly- et dermatomyosites :

Les marqueurs biologiques des poly- et dermatomyosites sont dominés par des autoanticorps non tant vis-à-vis d’antigènes nucléaires (Mi-2), ou nucléolaires (anti-PmScl), mais vis-à-vis d’antigènes cytoplasmiques constituants des protéines de traduction des mARN en protéines dans l’ergastoplasme.

Les anticorps les plus spécifiques sont les anti-synthétases dirigés contre des épitopes des enzymes branchant l’acide aminé sur l’ARN de transfert qui lui est propre.

Présents chez 25 % des polymyosites, les antisynthétases sont des marqueurs des atteintes pulmonaires de type fibrose interstitielle diffuse.

Le plus fréquent d’entre eux est l’anti-JO1.

Cet anticorps est dépisté par immunofluorescence indirecte sur HEp-2 où il donne un aspect de fluorescence cytoplasmique granuleuse diffuse et caractérisée, soit par double diffusion en gélose, soit plus aisément par un Elisa spécifique.

Les anti-JO1 sont très souvent associés à des anti-SSA/Ro de type 52 kD.

Les autres spécificités sont beaucoup plus rares.

Elles sont difficiles à caractériser faute de test standardisé simple.

Ces anticorps sont associés à des pronostics différents en termes de survie et de gravité des manifestations cliniques.

5- Anticorps antinucléaires associés au syndrome de Sjögren primitif :

Des anticorps antinucléaires mouchetés ou diffus sont présents dans 80 % des cas.

Les marqueurs les plus spécifiques sont les anticorps dirigés contre les antigènes nucléaires solubles SSA/Ro et SSB/La : les anti-SSA/Ro sont présents dans 40 à 60 % des cas selon les séries, les anti-SSB/La dans 50 à 60 % des cas.

Ces derniers sont plus spécifiques du diagnostic de syndrome de Sjögren primitif puisqu’on les trouve dans moins de 10 % des lupus et exceptionnellement dans d’autres circonstances.

Les anti-SSA/Ro sont beaucoup moins spécifiques, présents chez 30 % des lupus, 20 % des polymyosites (associés à l’anti-JO1) et dans nombre de connectivites indifférenciées.

L’apparition de tests Elisa spécifiques des protéines Ro 60 kDa et Ro 52 kDa a permis d’augmenter la sensibilité de cet examen effectué auparavant par diffusion double en gélose, mais n’a pas permis de différencier un profil propre au syndrome de Gougerot-Sjögren ou au lupus.

Anticorps antiphospholipides :

Les antigènes phospholipidiques sont composés d’un glycérol dont deux fonctions alcool sont estérifiées par des acides gras et la troisième fonction alcool primaire par un acide phosphorique formant habituellement un pont phosphodiester avec un autre composant aminoalcool tel que la sérine, la choline (lécithine) ou l’éthanol-amine (céphaline).

D’autres glycéro-phospholipides sont non azotés tels la cardiolipine ou diphosphatidyl-glycérol, molécule où deux diglycérides sont liés par une molécule d’acide phosphorique.

Enfin le phosphatidyl inositol est un glycérophospholipide non azoté dont le composant estérifié est un ose : l’inositol.

Les phospholipides anioniques tels que la cardiolipine, lorsqu’ils sont sous forme micellaire, se lient à un cofacteur plasmatique identifié comme étant l’apo-lipoprotéine H ou béta-2-glycoprotéine I (b2GPI).

Trois types de méthodes utilisant des principes différents sont pratiqués pour la détection des anticorps anti-phospholipides.

A - SÉROLOGIE SYPHILITIQUE :

La constatation d’une réaction de Bordet-Wassermann (BW) (utilisant une réaction de déviation du complément avec un antigène extrait du coeur de boeuf ou cardiolipine), positive contrastant avec un test de Nelson (utilisant un antigène tréponémique) négatif, fut à l’origine de la première description des anticorps antiphospholipides.

Cette dissociation des réactions de la syphilis est connue sous le nom de « fausse sérologie syphilitique ». Actuellement le BW est remplacé par le venereal disease research laboratory (VDRL).

L’antigène utilisé est un mélange de cardiolipide, de phosphatidylcholine et de cholestérol sous forme de micelles.

La positivité du VDRL contraste avec un treponema pallidum hemagglutination (TPHA) négatif, et surtout une réaction d’immunofluorescence avec l’antigène tréponémique négative.

B - MÉTHODES BIOLOGIQUES D’HÉMOSTASE :

Elles étudient l’interaction des anticorps antiphospholipidiques avec le complexe macromoléculaire appelé prothrombinase, capable de cliver la prothrombine en thrombine. Les anticorps antiprothrombinase allongent certains temps de coagulation, d’où leur appellation d’anticoagulants circulants (ACC).

Les anticorps responsables de l’activité anticoagulante circulante de type « antiprothrombinase » ou « lupus anticoagulant » (LA) sont de tout isotype et ne se fixent aux phospholipides en phase « liquide » que si ceux-ci sont associés à des protéines impliquées dans la cascade de la coagulation ou de la fibrinolyse pour former un complexe plurimoléculaire en présence d’ions calcium.

Le plus important de ces cofacteurs protéiques est la prothrombine qui rendrait compte de 70 % environ des anticoagulants lupiques.

L’autre cofacteur protéique principal est la b2-GPI qui rend compte de 30 % des anticoagulants lupiques.

Il est possible que d’autres facteurs protéiques soient la cible de l’activité anticoagulante lupique : citons la protéine C, la protéine S, l’annexine V et le kininogène de haut poids moléculaire (HMWK).

Compte tenu de la diversité des LA, un seul test d’hémostase est insuffisant pour dépister l’ensemble des anticoagulants circulants.

En France, on propose, pour la mise en évidence d’un LA, d’utiliser simultanément plusieurs tests dont le temps de céphaline activée (TCA) en exprimant les résultats en indice de Rosner [(A-B)/C] X 100 où A est le temps de coagulation du mélange (M + T), B celui du plasma témoin (T), C celui du plasma malade (M).

Il est positif s’il est supérieur ou égal à 13 ; le temps de thromboplastine diluée (TTD) avec une dilution de thromboplastine au 1/500.

Les résultats sont exprimés en rapport M + T/T.

Il est positif s’il est supérieur ou égal à 1,15 (1,20 si traitement par les antivitamines K [AVK]).

Enfin un test de neutralisation est effectué en ajoutant soit de la céphaline (test de Rosove) soit des extraits phospholipidiques plaquettaires (Staclot PNP), soit de la phosphatidyl-éthanolamine en phase hexagonale (Staclot LA).

Les Anglo-Saxons utilisent plus volontiers le test au venin dilué de vipère Russell (dRVVT) et le temps de Kaolin (KCT).

Ces tests ont l’avantage de dépister deux types différents de LA : des LA b2GPI dépendants (type A) qui constituent un tiers des LA et des LA prothombine dépendants qui constituent deux tiers des LA.

Il existe une concordance de positivité entre anticardiolipine et anticoagulant lupique chez 60 % des malades, et dans 40 % des cas un seul test est positif, habituellement l’Elisa anticardiolipine.

C - MÉTHODES IMMUNOLOGIQUES EN PHASE SOLIDE :

L’antigène phospholipidique est fixé sur un support solide où sa conformation est globalement différente de ce qu’elle est en phase liquide.

On utilise surtout la cardiolipine, mais il peut s’agir également de phosphatidyl sérine, d’un mélange de ces deux antigènes, de phosphatidyl choline, de phosphatidyl-éthanolamine, de phosphatidyl-inositol.

De nombreux problèmes techniques limitent l’interprétation des dosages en phase solide (Elisa, radioimmunologie [RIA]). Plusieurs ateliers de consensus ont permis d’aboutir à un certain degré de standardisation.

Les résultats, exprimés en unités GPL pour les IgG, MPL pour les IgM et APL pour les IgA, sont classés en négatifs, douteux, positifs et très positifs. Seuls des résultats positifs (³ 25 UGPL, soit > 5 DS) ou très positifs vérifiés à 2 mois d’intervalle sont retenus comme pertinents.

Les anticorps ainsi dosés sont dirigés, soit contre un épitope du phospholipide (anticardiolipine b2GPI indépendant), soit contre un épitope conformationnel sur le cofacteur protéique qui se lie aux phospholipides (présent dans le plasma ou le sérum servant à la préparation des tampons) et démasqué à l’occasion de cette liaison, (anticardiolipine b2GPI dépendant) soit contre un épitope de faible affinité de la b2 GPI lorsque cette protéine n’est pas sous forme d’un multimère (anti-b2GPI proprement dit).

Un dosage Élisa direct des anticorps anti-b2-GPI a été mis au point.

Les résultats obtenus sont très voisins de ceux obtenus avec la cardiolipine comme antigène.

Son avantage principal est de discriminer parmi les anticorps anticardiolipine, en première approximation, ceux qui sont b2-GPI dépendants et spécifiques de la b2-GPI humaine, seuls associés aux phénomènes thrombotiques, et d’ignorer les anticardiolipine qui reconnaissent réellement le phospholipide et non son cofacteur et qui sont réputés non associés aux manifestations de thrombose.

Il s’agit d’alloanticorps présents dans les sérums de sujets ayant une maladie infectieuse telle la syphilis ou des maladies virales tel le virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1) ou le virus C de l’hépatite.

Parmi les anticorps anticardiolipine b2-GPI-dépendants, certains ont une activité anticoagulante circulante lupique et d’autres en sont dépourvus.

Plusieurs autres anticorps anticofacteurs protéiques font actuellement l’objet d’investigations.

Les anticorps antiprothrombine sont présents chez 70 % des lupus avec anticoagulant circulant, 40 % des syndromes des antiphospholipides et 70 % des sujets ayant un anticoagulant circulant induit par une prise médicamenteuse.

Il s’agit, à fréquence égale soit d’IgG, soit d’IgM.

Les trois types de méthodes de détection des anticorps antiphospholipides sont de sensibilité différente, et détectent des anticorps dirigés contre des antigènes différents.

Ainsi s’expliquent les discordances entre les tests d’hémostase et les dosages Elisa ou les sérologies de la syphilis.

Il faut également savoir que les traitements corticoïdes ou immunosuppresseurs peuvent négativer temporairement les taux d’anticardiolipine et être sans action sur l’activité LA.

Enfin, à l’occasion d’un accident thrombotique, on peut voir disparaître les aPL, en particulier les anticardiolipine et les anti-b2GPI.

On évoque un phénomène de consommation.

On saura redemander un dosage quelques semaines plus tard.

Devant un tableau clinique de syndrome des antiphospholipides dit « séronégatif », où ces trois types de tests sont négatifs à plusieurs déterminations, on peut être amené à rechercher les autres isotypes d’anticardiolipine (IgM ou IgA) ou des anticorps dirigés contre un mélange de phospholipides, la phosphatidylsérine, la phosphatidyléthanolamine, mais ces recherches sont rarement positives, des anticorps de tous isotypes anticofacteurs, voire un anticoagulant circulant avec d’autres réactifs, avec préincubation à 37 °C du plasma ou encore des anticorps antimitochondries de type V souvent détectés en association avec un tableau de syndrome d’Evans.

Anticorps anticytoplasme de polynucléaires neutrophiles :

Décrits en 1982 par un test d’immunofluorescence chez des patients ayant une glomérulonéphrite nécrosante extracapillaire et des signes cliniques évocateurs de vascularite systémique, les anticorps, appelés par les Anglo-Saxons ANCA constituent actuellement un marqueur diagnostique précieux de certaines vascularites systémiques primitives.

A - CIBLES DES « ANTI-NEUTROPHIL CYTOPLASM ANTIBODIES » :

Ces anticorps reconnaissent différents antigènes présents dans les granules des polynucléaires neutrophiles, mais aussi des monocytes.

L’antigène PR3 (protéinase 3) de PM 29 kD est la cible principale des ANCA observés dans la granulomatose Wegener, alors que la myéloperoxydase (MPO) est la cible des ANCA observés dans la polyangéite microscopique (micro-PAN) et l’angéite granulomateuse de Churg et Strauss.

D’autres antigènes cibles des ANCA sont plus rarement incriminés : l’élastase, la cathepsine G, l’azurocidine, l’alphaénolase, la CAP 57 (cationic antigenic protein), la b glucuronidase, la protéine BPI (bactericidal/permeability increasing protein), la lactoferrine, le lysosyme.

Ces deux derniers antigènes sont situés dans les granules secondaires, les autres dans les granules primaires.

B - STRATÉGIE DE DÉPISTAGE ET DE CARACTÉRISATION :

Les ANCA sont actuellement dépistés en routine. Leur demande se justifie en présence de signes évocateurs de vascularite systémique ou devant une insuffisance rénale rapidement progressive d’origine glomérulaire.

Du fait de la relative rareté des affections associées aux ANCA, le rendement d’une telle recherche est très faible : 14/212 d’une série de malades suspects de vascularite ont des cANCA, 2 à 18% de suspicions de vascularite dans les hôpitaux écossais.

1- Immunofluorescence indirecte sur polynucléaires humains :

L’immunofluorescence indirecte sur polynucléaires humains constitue la méthode de détection de référence internationalement reconnue.

Les polynucléaires isolés sur gradient de densité sont étalés ou cytocentrifugés, et fixés à l’alcool absolu à 4°.

La révélation se fait avec un antisérum polyvalent capable de reconnaître les trois isotypes d’immunoglobulines humaines.

Deux aspects principaux dans la fluorescence sont observés : un aspect granuleux diffus (CANCA) et un aspect de la fluorescence du cytoplasme à la périphérie du noyau (P-ANCA).

Il a été montré que l’aspect périphérique était lié à un artefact de fixation entraînant une redistribution des granules autour des noyaux du polynucléaire.

L’utilisation d’un autre fixateur tel que le formol acétone, permet d’éviter une telle redistribution et facilite ainsi la distinction entre les P-ANCA et les anticorps antinucléaires spécifiques de polynucléaires, parfois observés dans les polyarthrites rhumatoïdes avec ou sans syndrome de Felty et vascularite.

Ces anticorps antinucléaires qui ne reconnaissent que les noyaux des polynucléaires sont appelés dans la littérature anglo-saxonne GSANA (granulocyte specific antinuclear antibodies).

L’utilisation conjointe des deux types de fixation est actuellement recommandée pour distinguer les différents types d’anticorps. Outre ces trois types de fluorescence on a décrit des aspects « atypiques » (« X »-ANCA) en particulier un aspect diffus et homogène du cytoplasme dont la signification reste à l’étude.

Il s’agit dans certains cas d’anticathepsine G, mais habituellement on ne connaît pas l’antigène reconnu.

Plusieurs variantes de cette méthode de référence qu’est l’immunofluorescence sur polynucléaires humains, ont été proposées pour le dépistage des ANCA : citons l’utilisation d’un anti-sérum marqué à la peroxydase qui permet une distinction aisée entre P-ANCA et GS-ANA, utilisation de frottis de sang de sujets atteints de leucémie myéloïde chronique fixé en formol acétone, ou de lignée cellulaire humaine promyélocytaire HL 60 en sachant que certaines souches de cellules HL 60 n’expriment plus, après plusieurs passages, l’antigène PR3.

Il est en effet intéressant de souligner que les ANCA reconnaissent non seulement les constituants des polynucléaires, mais également ceux des monocytes.

Quel que soit le substrat utilisé, ces techniques d’immunofluorescence ou d’immunoperoxydase permettent d’étudier la classe et la sous-classe d’immunoglobulines ainsi que le titre des anticorps anticytoplasme de polynucléaires neutrophiles.

2- Méthodes de dosage en phase solide :

Les ANCA sont aussi détectés par des tests quantitatifs radioimmunologiques (RIA) ou immunoenzymatiques (Elisa) en utilisant comme antigène, soit des granules purifiés, soit des protéines isolées par extraction ou colonnes d’immunoaffinité.

Différentes trousses commerciales sont disponibles pour le dosage des anticorps anti-PR3 (protéine 29 kD) ou anti-MPO.

Certaines permettent aussi le dosage des antiélastase, anticathepsine G, antilactoferrine et antilysozyme.

Il n’existe pas de très bonne corrélation entre les titres d’ANCA déterminés par immunofluorescence indirecte et les titres obtenus par ces méthodes en phase solide.

Des dissociations dans les deux sens sont possibles.

Les sérums positifs par IF sont cependant très habituellement positifs en Elisa et inversement.

C - VALEUR DIAGNOSTIQUE DES « ANTI-NEUTROPHIL CYTOPLASMIC ANTIBODIES » :

1- Diagnostic associé aux différents types d’« anti-neutrophil cytoplasmic antibodies » :

Schématiquement, on peut retenir que les C-ANCA se voient dans la maladie de Wegener, dont ils sont un marqueur sensible et spécifique, et accessoirement dans certaines vascularites avec une glomérulonéphrite rapidement progressive, telle que la PAN microscopique.

Les P-ANCA se rencontrent essentiellement dans les PAN microscopiques et les glomérulonéphrites (GN) rapidement progressives pauci-immunes, dans la granulomatose allergique de Churg et Strauss, et accessoirement dans la polychondrite atrophiante, la rectocolite hémorragique, la cholangéite sclérosante, beaucoup plus exceptionnellement dans les polyarthrites rhumatoïdes, les connectivites, diverses infections (tuberculose, surtout amibiase viscérale et infection à PV B19, infection chez des VIH), et après certaines prises médicamenteuses (D-pénicillamine, allopurinol, propylthiouracil, L-tryptophane, hydralazine, clozapine, oméprazole, …).

2- Valeur diagnostique d’une variation du taux d’« anti-neutrophil cytoplasmic antibodies » :

Le taux d’ANCA varie sous traitement corticoïde et immunosuppresseur.

Ainsi les c-ANCA diminuent ou disparaissent en 6 semaines à 3 mois après traitement initial d’une maladie de Wegener active.

La question reste posée de l’utilité du dosage répété pour suivre l’évolution de cette affection à rechute. Les séries prospectives ont montré qu’une concordance clinico-biologique était observée dans 50 à 60 % des cas avec une réascension des taux précédant une rechute clinique (35 % des cas).

Néanmoins, dans un tiers des cas, il existe une dissociation : soit les taux restent élevés durant une rémission, soit les taux restent indétectables ou bas à l’occasion d’une poussée.

La persistance de taux élevés est cependant plus fréquente chez les sujets qui vont rechuter.

Des constatations analogues ont été faites pour les maladies associées aux P-ANCA.

Les corrélations clinico-biologiques sont moins mauvaises avec les dosages en IF qu’avec les dosages en Elisa.

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