On dispose d’une souche C de coli, prototrophe et résistante au phage Tx,
phénotype noté [TxR], à partir de laquelle on prépare un lysat de phage
transducteur P1, pour transduire une souche réceptrice [gal–, pyr–],
sensible au phage Tx.
1. L’analyse, par répliques, de 210 recombinants [gal+] donne les résultats
suivants, que vous interpréterez :
[TxS, pyr–] : 55 [TxR, pyr–] : 45 [TxS, pyr+] : 5 [TxR, pyr+] : 105
2. À partir de la souche C, on isole quatre mutants indépendants [gal–],
notés m1, m2, m3 et m4 qui sont restés résistants au phage Tx et prototrophes
pour les pyrimidines.
Puis, par transduction, on sélectionne les dérivés [gal–, TxS, pyr–] de ces
mutants, notés d1, d2, d3 et d4.
On est alors en mesure de transduire les souches d1, d2, d3 et d4 par des
lysats de phages transducteurs P1 obtenus sur m1, m2, m3 ou m4
(tabl. 9.3).
On sélectionne alors les recombinants [gal+, pyr+] et on teste, par répliques,
la résistance au phage Tx (tabl. 9.3).
Faire une carte fine des mutations gal affectant les mutants m1, m2, m3
et m4 (schémas indispensables pour la démonstration).
TABLEAU 9.3.
– Transduction, cartographie de gènes par test trois points.
– Cartographie de sites par test quatre points.
Solution
1. Le fait d’obtenir des recombinants [gal+; pyr+; TxR] prouve que les trois gènes (s’il s’agit
de trois gènes différents) sont cotransduits et, donc, localisés assez près les uns des autres
(dans 100 000 pb au plus).
La question est donc de savoir lequel des trois gènes est central.
L’estimation des différents types de recombinants parmi les [gal+] permet de répondre à cette
question, il s’agit d’un test trois points.
Plusieurs méthodes de raisonnement existent, l’une d’entre elle (tabl. 9.4) consiste à détailler
et à dénombrer tous les événements susceptibles de donner les différents types de recombinants,
sous les trois hypothèses cartographiques, puis de confronter les résultats attendus à
ceux observés, afin d’en déduire la bonne cartographie, en excluant deux des trois hypothèses
et en démontrant que celle qui reste est la seule valable (double argumentation négative
et positive).
Le troisième ordre (pyr central, tabl. 9.4) est incohérent avec les observations, car le recombinant
[TxR; pyr–] exigerait alors quatre recombinaisons et ne saurait être plus fréquent que
le recombinant [TxS; pyr+] qui n’en exigerait que deux (un recombinant étant d’autant plus
rare que le nombre d’événements de recombinaisons pour le former est élevé).
Cet ordre est
donc exclu car incohérent avec les observations.
Le deuxième ordre (tx central) est cohérent avec les observations, car le recombinant
[TxS; pyr+] qui exige quatre recombinaisons est bien le plus rare des recombinants observés,
les autres n’exigeant que deux recombinaisons.
Remarque. Les fréquences respectives des trois autres recombinants n’exigeant que
deux événements de recombinaisons dépendent alors des tailles respectives des zones
de recombinaison, la probabilité d’un événement de recombinaison étant d’autant
plus élevée que la zone a une taille plus grande.
TABLEAU 9.4 TROIS CARTOGRAPHIES POSSIBLES. Pour chacune, l’événement sélectionné par l’étalement (sélection des recombinants
[gal+] est indiqué en gras, puis, sur chaque ligne, les sites de recombinaisons
nécessaires pour obtenir les différents types de recombinants observés. Les
chiffres 1, 2, 3 et 4 indiquent les zones où une recombinaison moléculaire est
nécessaire pour intégrer le gène du recombinant obtenu. (On préférera garder le
terme de crossing-over pour les recombinaisons réciproques observées dans la
méiose des diploïdes.)
Mais pour accepter cette cartographie (Tx central), il est également nécessaire de rejeter le
premier ordre en démontrant son incohérence avec les observations.
Ici le raisonnement est
différent, car tous les recombinants n’exigeraient que deux événements de recombinaisons;
il consiste à comparer deux groupes de recombinants afin de démontrer l’incohérence entre
l’ordre postulé et les observations :
– parmi les recombinants résistants, les recombinants [pyr+] sont plus fréquents que les
recombinants [pyr–], ce qui permet de conclure, en fonction de la remarque précédente,
que la zone 4 est au moins deux fois plus grande que la zone 3;
– parmi les recombinants sensibles, les recombinants [pyr+] sont moins fréquents que les
recombinants [pyr–], ce qui permet de conclure, en fonction de la même remarque, que la
zone 4 est environ dix fois plus petite que la zone 3.
Comme une zone ne peut à la fois être plus grande et plus petite qu’une autre, cet ordre
aboutit à une incohérence avec les résultats, ce qui permet de le rejeter.
2. Il est proposé ici de faire une carte fine par un test 4-points, le marqueur Tx servant de
référence interne pour situer les mutations gali et galj.
En effet, la carte est connue pour les locus gal, Tx et pyr, il ne s’agit que de situer les mutations
gal.
Pour chaque croisement, deux cartes sont possibles (fig. 9.4), où sont indiquées, en traits
pleins, les recombinaisons obligatoires, compte tenu des phénotypes recombinants [gal+, pyr+]
sélectionnés, et, en pointillés, (grands ou petits) les recombinaisons qui ont pu, selon les cas,
conduire à des phénotypes sensibles ou résistants pour le phage Tx.
Figure 9.4 Carte des mutations.
La séquence Tx est centrale, deux ordres sont possibles selon que gali est central
entre galj et Tx ou selon que galj est central entre gali et Tx.
Dans le cas du premier ordre, la fréquence des recombinants résistants sera nettement supérieure
à celle des sensibles, car deux recombinaisons supplémentaires (en plus de celles qui
sont sélectionnées pour apporter pyr+ et gal+) sont nécessaires pour avoir des recombinants
sensibles.
Dans le cas du deuxième ordre, le nombre de recombinaisons est le même et les fréquences
des résistants et des sensibles ne dépendront que des distances respectives du locus Tx au
locus gal et pyr.
Or, compte tenu des résultats du test trois points de la question précédente, la recombinaison
entre les locus Tx et gal (55 cas) est aussi fréquente que celle entre Tx et pyr (45 cas), ce qui
permet d’affirmer qu’on attend alors autant de recombinants résistants que de sensibles.
Donc si gali (donatrice) n’est pas central, la fréquence des résistants sera nettement supérieure
à celle des sensibles et si gali est central, la fréquence des résistants sera à peu près
égale à celle des sensibles. D’où la possibilité d’ordonner les sites de mutation (fig. 9.5).
Figure 9.5 Ordre des sites de mutation gal.
La première transduction (donatrice m1, réceptrice m2) donne 43 résistants et
42 sensibles donc m1 est central entre m2 et Tx; la deuxième transduction donne
92 résistants pour 10 sensibles, donc m1 est extérieur, m3 est central entre m1
et Tx, etc.
Exercice 9.3
On dispose de quatre souches Hfr comme indiqué en annexe et d’une souche F–,
porteuse d’une mutation responsable du phénotype [gal–] et résistante à la
rifampicine (un antibiotique).
Pour localiser cette mutation on réalise en parallèle quatre croisements entre
la souche F– et chaque Hfr, durant 45 mn et on étale sur un milieu adéquat.
a. Quel est ce milieu ?
b. On observe des colonies uniquement
dans la boîte d’étalement
du croisement avec les Hfr1 :
désignez, très précisément, sur
la carte en annexe, sans justification,
la position de la mutation
responsable du phénotype [gal–].
La carte jointe indique l’origine
et le sens de transfert du chromosome
dans chacune des Hfr.
NB : pour Hfr1 ou Hfr2, thr (thréonine) est donc très proche de l’origine
de transfert.
On rappelle que le passage du chromosome entier exige ici
90 minutes.
Solution
1. M0(gal) + rifampicine, pour sélectionner des réceptrices (rifampicine) ayant reçu et
recombiné la séquence GAL+.
2. Il suffit de tirer un diamètre à partir de chaque origine de transfert pour visualiser la demicirconférence
génomique (45 mn) transmise et voir que les observations situe la séquence
GAL+ à 14 heures sur le génome, le locus thr correspondant au « midi » de l’horloge, un peu
en « amont » de l’origine de transfert de la Hfr2.
