Système du plasminogène et son exploration Cours
d'hématologie
Introduction
:
La coagulation construit le caillot, la fibrinolyse le dissout pour
faciliter la reperméabilisation d’un vaisseau.
Un équilibre entre
coagulation et fibrinolyse est nécessaire à l’hémostase physiologique.
Cette capacité de l’organisme à dissoudre un caillot ou des dépôts
fibrineux est connue depuis plus de 100 ans (Dastre, 1893), mais les
études entreprises sur les mécanismes biochimiques complexes sont
plus récentes.
Elles ont identifié la réaction fondamentale du système
fibrinolytique, qui est l’activation localisée du plasminogène en
plasmine au niveau d’un thrombus hémostatique.
Le système fibrinolytique, de même que celui de la coagulation, fait
intervenir des activateurs et des inhibiteurs.
Le système
fibrinolytique intervient dans la dissolution de fibrine intraet
extravasculaire.
Il joue un rôle également dans la réaction
inflammatoire, la cicatrisation des plaies, la fonction phagocytaire
des macrophages, l’ovulation, l’embryogenèse et même la
carcinogenèse.
Les activateurs essentiels du plasminogène sont le t-PA ou activateur tissulaire du plasminogène,
et l’urokinase (u-PA), elle-même dérivée d’une pro-urokinase.
Les
travaux récents ont également montré le rôle de la plasmine dans
l’activation des métalloprotéases qui sont impliquées dans la
destruction de la matrice extracellulaire et de nombreux
précurseurs de cytokines, et le rôle de nombreux récepteurs du
plasminogène et de ses activateurs.
Ainsi, un récepteur de
l’urokinase ou U-PAR joue un rôle important dans la migration
cellulaire et le remodelage tissulaire.
Les deux inhibiteurs les plus importants sont le PAI-1 (plasminogen
activator inhibitor-1) et l’alpha2-antiplasmine.
Ils appartiennent à la
grande famille des serpines (serine protease inhibitors).
Le facteur
intervenant dans le système de la fibrinolyse le plus récemment
découvert est le TAFI (thrombin activatable fibrinolysis inhibitor) qui
est activé par la thrombine au cours de la formation du caillot et le
protège contre sa dissolution prématurée.
Un caractère très particulier du système du plasminogène est que la
fibrine est elle-même suicidaire, puisqu’elle favorise sa propre
destruction en catalysant la réaction entre le plasminogène et le t-PA
aboutissant à la plasmine.
Une fibrinolyse excessive entraîne des
hémorragies, tandis qu’une diminution de l’activité
fibrinolytique favorise les thromboses.
Récemment encore, la connaissance du rôle du système
fibrinolytique a fait de nouveaux progrès grâce à l’étude d’animaux
génétiquement déficients, incapables de synthétiser un ou plusieurs
éléments du système fibrinolytique.
La multiplicité des rôles de la plasmine, en dehors de ceux propres
à la fibrinolyse, fait actuellement préférer le terme de système du plasminogène à celui du système fibrinolytique.
Principaux constituants du système
du plasminogène :
Toutes les sérines protéases du système de coagulation et du système
fibrinolytique existent sous forme d’une molécule inactive appelée
zymogène constituée d’une seule chaîne moléculaire, à l’exception
du t-PA, qui est actif dans sa forme monocaténaire.
Elles sont
transformées en molécules actives par le clivage d’une ou plusieurs
liaisons.
Il existe une homologie de structure entre les différentes
sérines protéases par la présence de plusieurs domaines : le domaine
en doigt de gant (finger domain ou F), un domaine ayant une
homologie avec un facteur de croissance (epidermal growth factor ou
EGF) et le domaine kringle (K), du nom d’une pâtisserie danoise de
forme voisine de celle d’un croissant français.
Ces kringles existent
également dans des molécules des facteurs de coagulation.
Ceux de
la prothrombine, du plasminogène et du t-PA ont été purifiés et
caractérisés. Un autre domaine appelé domaine en forme de pomme
existe uniquement dans la kallikréine.
Le domaine protéasique (P)
se trouve sur le côté C-terminal de la molécule, et contient le site
actif qui est constitué des trois acides aminés : sérine, histidine et
acide aspartique.
L’homologie de structure des sérines protéases a
fait émettre l’hypothèse de leur origine à partir d’une molécule
ancestrale commune.
A - PLASMINOGÈNE :
1- Structure
:
Le plasminogène humain, précurseur de la plasmine, est une
glycoprotéine constituée d’une seule chaîne peptidique comprenant
791 acides aminés, 24 ponts disulfures, et environ 2 % d’hydrates de
carbone. Son poids moléculaire est voisin de 92 kDa.
La
molécule comprend sept domaines structurels composés d’une
chaîne peptidique appelée peptide de préactivation, correspondant
aux acides aminés 1 à 77, puis cinq séquences homologues appelées
kringles K1 à K5.
Chaque kringle est formé d’environ 80 acides
aminés et comprend trois ponts disulfures intramoléculaires.
L’extrémité de la chaîne comporte le site responsable de l’activité
protéolytique P, formé des acides aminés 562 à 791.
Les kringles confèrent au plasminogène sa capacité à se lier aux
résidus lysine de la fibrine et de l’alpha2-antiplasmine ou d’autres
glycoprotéines comme la tétranectine, la glycoprotéine riche en
histidine, le collagène, le kininogène, la matrice extracellulaire, la
thrombospondine, l’immunoglobuline (Ig)G et les récepteurs
membranaires.
L’affinité et la spécificité des kringles sont différentes
vis-à-vis de certains ligands.
De faibles concentrations d’acide e-aminocaproïque (EACA) ou de
lysine diminuent considérablement la fixation du plasminogène aux
protéines plasmatiques (en particulier la fibrine).
Cette propriété est
utilisée pour la purification du plasminogène par chromatographie
d’échange d’ions sur diéthylaminoéthylcellulose (DEAE cellulose) à
pH légèrement acide, ou par chromatographie d’affinité dans
laquelle la L-lysine est immobilisée sur une colonne de sépharose.
La forme native du plasminogène est le Glu-plasminogène, qui
possède un acide glutamique à son extrémité N-terminale.
Il existe
sous deux formes qui diffèrent par leur degré de glycosylation : une
forme glycosylée au niveau de l’Asn289 et de la Thr346, et une
forme glycosylée uniquement au niveau de la Thr346.
Chacune
des deux formes est subdivisée en six isoformes différentes dont les
points isoélectriques (pI) sont compris entre 6,1 et 6,6.
Toutes ces
formes moléculaires existent dans le plasma d’un même individu.
En l’absence de fibrine, la première forme est activée plus facilement
en plasmine que la deuxième, mais en présence de fibrine aucune
différence d’activation n’a été mise en évidence.
Le plasminogène
peut subir des modifications post-transcriptionnelles, comme la
phosphorylation de la Ser578 et la glycosylation des Ser249 et 339.
Le plasminogène est synthétisé essentiellement par le foie, mais les
polynucléaires éosinophiles, le rein et la cornée sont aussi capables
de le synthétiser.
Chez un individu normal, sa concentration
plasmatique est de l’ordre de 2 µM, soit environ 200 mg/L, et
augmente au cours des états infectieux ou inflammatoires et pendant
le dernier trimestre de grossesse.
Sa concentration plasmatique est
deux fois plus faible chez le nouveau-né à terme, et beaucoup plus
faible encore chez l’enfant prématuré. Une diminution est également
observée dans les atteintes hépatiques et au cours des traitements thrombolytiques.
La demi-vie du plasminogène natif est de l’ordre
de 50 heures, alors que celle de la forme dégradée n’est que de
20 heures.
2- Gène du plasminogène :
Le gène du plasminogène humain est localisé sur le bras long du
chromosome 6 au niveau de la bande 6q26-q27, sur une longueur de
52,5 kb au voisinage des gènes de la lipoprotéine(a).
Il est
organisé en 19 exons séparés par 18 introns.
Le premier exon code le
peptide signal ; le peptide d’activation et chaque kringle sont
déterminés par deux exons. Les six autres exons codent la partie protéasique de la molécule.
La grossesse et l’interleukine 6 induisent
une augmentation de l’expression du gène du plasminogène.
Les souris déficitaires en gène de plasminogène (souris plg–/–)
développent des dépôts fibrineux au niveau du foie, comme chez
les souris ayant un double déficit en t-PA et en urokinase, et
sont prédisposées à des thromboses sévères et des lésions
thrombotiques au niveau du tractus gastro-intestinal, du foie, du
poumon, du pancréas et dans d’autres tissus.
L’administration de plasminogène en bolus corrige ces anomalies
et diminue partiellement ces dépôts de fibrine.
3- Dysplasminogénémie et déficience en plasminogène :
Au moins une douzaine de mutants du plasminogène a été décrite
chez des patients souvent asymptomatiques, mais qui peuvent être
facteurs de risque de thromboses récidivantes et/ou d’une
conjonctivite ligneuse.
Ces mutants peuvent être du type I (taux
d’antigène et d’activité réduits : déficience en plasminogène) ou de
type II (taux d’antigène normal mais activité réduite :
dysplasminogénémie).
Il est intéressant de noter qu’une conjonctive
produit du plasminogène, alors qu’une conjonctivite ligneuse est
caractérisée par un dépôt important de fibrine au niveau oculaire.
L’administration de plasminogène par voie intraveineuse chez les
malades atteints de conjonctivite ligneuse améliore rapidement ces
lésions.
4- Conformation Glu- et Lys-plasminogène :
Les acides x-aminocarboxyliques sont des agents antifibrinolytiques
qui inhibent l’activité de la plasmine in vitro et in vivo par leurs
liaisons aux sites de fixation de la lysine (LBS : lysine binding sites) de
la plasmine ou du plasminogène.
Cependant, à faible concentration,
ces composés n’inhibent pas l’activation du plasminogène mais,
paradoxalement, augmentent la vitesse de cette activation.
En l’absence
de l’acide EACA, le Glu-plasminogène a une configuration fermée par
l’interaction de la Lys50 du peptide d’activation N-terminal avec les
LBS des kringles.
En revanche, en présence de 5 mM d’EACA, cette
interaction est rompue, la molécule prend une configuration plus
ouverte et devient plus accessible aux activateurs.
Le clivage du
peptide d’activation du Glu-plasminogène provoque des changements
conformationnels identiques.
La demi-vie du Lys-plg est plus courte.
Ce dernier s’active plus
facilement en plasmine et possède une plus forte affinité pour la
fibrine que le Glu-plg.
5- Activation du plasminogène :
Les activateurs du plasminogène agissent par l’hydrolyse de la
liaison peptidique Arg561-Val562 du plasminogène, pour donner
naissance à une molécule de plasmine composée de deux chaînes.
La chaîne B de la Glu-plasmine reste attachée à la chaîne A
par deux ponts disulfures.
L’activation du Glu-plg in vitro génère
des traces de plasmine qui provoquent l’hydrolyse des liaisons
Arg68-Met69, Lys77-Lys78 et Lys78-Val79 pour donner naissance à
des formes dégradées de plasminogène comme le Lys78-plg, le
Met69-plg et le Val79-plg.
Dans les conditions physiologiques, l’activation du plasminogène est
contrôlée à différents niveaux, et la plasmine libre est très
rapidement neutralisée par l’alpha2-antiplasmine.
Dans un plasma
normal, l’utilisation d’anticorps monoclonaux dirigés contre le Lysplg
n’a révélé aucune présence de Lys-plg libre ni de Lys-plasmine.
Seules des traces de ces composés ont été mises en évidence chez les
patients ayant reçu un traitement thrombolytique.
6- Propriétés de la plasmine
:
Les propriétés de la plasmine sont similaires à celles de la trypsine.
Outre son rôle dans la fibrinolyse et la fibrinogénolyse, la plasmine
agit sur d’autres protéines du système d’hémostase (comme les
facteurs V, VIII, XIII activés, le facteur von Willebrand et les
glycoprotéines plaquettaires), sur certaines fractions du complément,
et peut activer des proformes de facteurs de croissance et de
métalloprotéases en formes actives.
L’action de la plasmine sur le
fibrinogène et sur la fibrine aboutit à un grand nombre de produits
de dégradation dont la structure chimique a été établie.
La
plasmine libre est rapidement neutralisée par l’alpha2-antiplasmine, et
est éliminée de la circulation avec une demi-vie de 4,5 heures.
7- Liaison du plasminogène à la fibrine
:
L’activation du plasminogène en plasmine est très limitée dans le
temps et dans l’espace, car elle doit être localisée sur la fibrine
formée et éviter une protéolyse généralisée qui peut attaquer
d’autres protéines.
Le but principal du système du plasminogèneplasmine
est non seulement de lyser le caillot formé, mais aussi de
prévenir la formation excessive de fibrine.
Le Lys-plg a une affinité plus forte pour la fibrine native que le Gluplg.
Cette différence disparaît pour la fibrine dégradée,
probablement par le changement de conformation du Glu-plg.
La
séquence 148-160 sur la chaîne a de la fibrine a été identifiée comme
le site principal de fixation du plasminogène sur la fibrine native
polymérisée.
Or, une fois la lyse de la fibrine mise en route, de
nouveaux résidus lysine C-terminaux sont générés sur la fibrine et
fixent de nouvelles molécules de plasminogène, produisant ainsi une accélération
de la lyse.
8- Angiostatine :
L’angiostatine est un fragment de 38 kDa issu de la protéolyse du
plasminogène.
Elle est formée par les quatre premiers kringles (K1 à
K4). Dans la plupart des cellules tumorales, on a identifié des
protéases qui dégradent le plasminogène et génèrent de
l’angiostatine.
L’élastase sécrétée par les macrophages et la
stromélysine-1 peuvent générer des fragments similaires à ceux de
l’angiostatine.
In vitro, l’angiostatine inhibe la prolifération et la
migration des cellules musculaires lisses, joue un rôle dans la
prévention de l’athérosclérose, et induit l’apoptose de cellules
endothéliales en culture.
B - ACTIVATEURS PHYSIOLOGIQUES DU PLASMINOGÈNE :
1- Urokinase et pro-urokinase :
L’urokinase urinaire est produite par les cellules rénales et excrétée
dans l’urine.
Des études en immunohistochimie ont montré la
présence d’urokinase dans les fibroblastes du tissu conjonctif, dans
les cellules épithéliales et dans les monocytes-macrophages.
Sous
l’effet des endotoxines ou du TNF (tumor necrosis factor), les cellules
endothéliales en culture sont capables de produire de l’urokinase.
In
vivo, sa synthèse a été démontrée au niveau de l’endothélium
vasculaire.
L’urokinase a été préparée également par génie
génétique.
La fonction principale de l’urokinase est exercée au niveau des
tissus, dans les processus de migration cellulaire, du remodelage
tissulaire, de dégradation de la matrice extracellulaire, de l’invasion
tumorale et de la formation de métastases.
* Différentes formes de l’urokinase :
La pro-urokinase ou scu-PA (single chain urinary-type plasminogen
activator) est une protéine de 55 kDa.
Elle est constituée d’une seule
chaîne de 411 acides aminés dont 24 sont des cystéines formant 11
ponts disulfures.
Sa concentration plasmatique est de
l’ordre de 2 à 4 ng/mL.
Sa demi-vie de 7 minutes environ est
comparable à celle de l’activateur de plasminogène de type tissulaire
(t-PA).
Son catabolisme est assuré par le foie.
Le domaine EGF interagit avec les récepteurs cellulaires de
l’urokinase, et intervient dans la mitogenèse et la différenciation
cellulaire.
Le kringle n’a pas d’affinité pour la fibrine, son rôle est
encore mal connu.
Il est lié par un peptide relativement long au
domaine protéolytique P.
Le domaine C-terminal est formé de 252
acides aminés et contient le site actif qui comprend les acides aminés
His204, Asp255, et Ser356.
La scu-PA ne réagit pas avec les
inhibiteurs des protéases, mais elle reste stable dans le plasma et
conserve son potentiel fibrinolytique.
Différentes enzymes, dont la plasmine et la kallikréine, peuvent
scinder la pro-urokinase au niveau de la liaison Lys158-Ile159,
donnant naissance à deux formes d’urokinase :
– une urokinase de haut poids moléculaire.
Formée d’une chaîne
lourde de 30 à 33 kDa contenant le site actif lié par un pont disulfure
à une chaîne légère de 20 à 22 kDa, cette forme à deux chaînes est
appelée tcu-PA (two chain urinary-type plasminogen activator) ;
– une urokinase de bas PM. C’est la forme dégradée de l’urokinase
de haut PM ayant conservé sa chaîne lourde et un fragment de
2,4 kDa de la chaîne légère.
Ces deux formes sont rapidement inactivées par le PAI-1, avec une
demi-vie d’inactivation de l’ordre de 4 à 7 minutes.
* Gène de l’urokinase :
Le gène humain de l’urokinase est situé sur le chromosome 10 au
niveau de la bande q24, sur une longueur de 6,4 kb.
Il est constitué
de 11 exons.
Dans la région flanquante en 5’ du gène de la scu-PA
se trouvent plusieurs éléments cis-régulateurs qui interagissent avec
des facteurs de transcription, et modulent ainsi l’expression de la
scu-PA.
Parmi ces éléments cis-régulateurs, on a identifié des motifs
d’acide désoxyribonucléique (ADN) qui lient les facteurs de
transcription AP1, CREB/ATF, Ets, GR, NF-jB et autres.
À une
distance de 2 kb, en amont du site d’initiation de la transcription, se
trouve une région stimulatrice de transcription (enhancers).
Une
description détaillée de ces éléments cis- et transrégulateurs et une
bibliographie étendue ont été publiées.
* Études génétiques chez la souris
:
L’équipe de Carmeliet a étudié des souris génétiquement déficientes
en facteurs du système fibrinolytique.
Il n’existe pas de déficit
homozygote connu du t-PA ou d’u-PA chez l’homme, et curieusement, cette malformation a été considérée comme
potentiellement létale.
Les souris déficientes en gène de l’u-PA (u-
PA–/–), développent des dépôts mineurs de fibrine dans le foie et les
intestins, et des dépôts importants dans des ulcérations chroniques
non cicatrisantes de la peau sans formation spontanée de thrombi
vasculaires.
La cicatrisation des plaies et le système immunitaire sont
détériorés.
La lyse d’un caillot de fibrine marqué à l’iode 125,
injecté dans la veine jugulaire et embolisé dans l’artère pulmonaire,
est comparable à celle des souris sauvages.
* Propriétés pharmacologiques
:
L’urokinase, quelle que soit sa forme moléculaire, provoque le
clivage de la liaison Arg561-Val562 du plasminogène, et le
transforme en une molécule de plasmine formée de deux chaînes
liées par deux ponts disulfures.
Le Glu-plg est plus facilement
activé par l’urokinase de haut PM que par l’urokinase de bas PM.
La Glu-plasmine formée peut, par action protéolytique, agir sur une
deuxième molécule de Glu-plg, et conduire au Lys78-Plg par
l’hydrolyse d’une liaison située sur la partie N-terminale.
Contrairement à la tcu-PA, la scu-PA a une certaine spécificité pour
la fibrine, car elle provoque une faible protéolyse du fibrinogène, du
plasminogène et de l’alpha2-antiplasmine, qui sont mieux préservés.
Le t-PA et la scu-PA agissent par des mécanismes différents et
complémentaires.
Au fur et à mesure que la fibrine se dégrade, de
nouveaux résidus lysine C-terminaux sont générés sur la chaîne a et
augmentent la vitesse de fixation du Glu-plg sur la fibrine.
La scu-PA a une forte affinité pour le plasminogène (Kd = 65 nM) et
active sélectivement le Glu-plg lié à la fibrine partiellement
dégradée.
Collen et ses collaborateurs ont étudié les effets thrombolytiques du
t-PA et de la scu-PA sur un modèle de thrombose de la veine
jugulaire de lapin.
Ils ont conclu qu’une thrombolyse par du t-PA
suivie par une administration de scu-PA, est plus efficace qu’une
thrombolyse par la scu-PA suivie de t-PA.
Au cours de la coagulation, la kallikréine générée par l’activation
du système contact transforme la scu-PA en tcu-PA.
Ce processus
peut avoir lieu en l’absence de plasminogène.
Dans les conditions
physiologiques ou pathologiques, et contrairement au t-PA et au
PAI-1, la concentration plasmatique circadienne de l’u-PA reste
stable.
* Récepteurs de l’urokinase (u-PAR)
:
L’activité catalytique de la scu-PA est augmentée d’environ 100 fois
quand elle est liée à son récepteur membranaire des monocytes et
des autres cellules, ce qui accélère fortement la lyse d’un
thrombus.
L’u-PAR est un polypeptide de 55 kDa, constitué de
313 acides aminés.
Le gène de l’u-PAR est situé sur le chromosome
19, sur une longueur de 23 kb.
Il est formé de sept exons et de six
introns.
Son expression est induite par plusieurs facteurs comme des
promoteurs tumoraux, des facteurs de croissance, des cytokines et
des hormones.
L’u-PAR est attaché aux phospholipides membranaires par un
glycosyl phosphatidyl inositol (GPI) qui peut être hydrolysé par une
phospholipase C (PLC) spécifique du phosphatidyl inositol.
Son
extrémité N-terminale est formée d’un domaine de fixation de
l’urokinase, et de deux autres domaines qui facilitent cette fixation.
L’u-PA fixée à l’u-PAR (et convertie en tcu-PA) est accessible à
l’inactivation par le PAI-1.
Le complexe ternaire tcu-PA/u-
PAR/PAI-1 est internalisé, et l’u-PAR est recyclé sur la surface
cellulaire.
Ce processus exige la présence d’un autre récepteur
appelé LRP (lipoprotein related protein).
À l’origine, on pensait que
l’u-PAR jouait les seules fonctions de localiser et d’augmenter
l’activation du plasminogène par l’u-PA à la surface cellulaire, mais
d’autres activités ont été mises en évidence.
L’u-PAR activé par
l’u-PA interagit avec la vitronectine et la b1-intégrine, déclenchant
l’adhésion cellulaire et la transduction de signaux intracellulaires, et active le récepteur chimiotactique FPRL1/LXA4R,
établissant ainsi une relation entre système fibrinolytique et
inflammation.
Il existe d’autres récepteurs de l’u-PA qui interviennent soit dans la
stimulation de l’activation du plasminogène, soit dans l’élimination
des complexes u-PA/serpines circulants.
Ces derniers sont le
récepteur de l’asialoglycoprotéine, localisé principalement dans les
cellules hépatiques, et le récepteur des lipoprotéines de très faible
densité ou VLDL (very low density lipoproteins).
2- Activateur tissulaire du plasminogène (t-PA)
:
Le t-PA est une sérine protéase de 68 kDa, présent dans le plasma
humain à la concentration de 5 µg/L.
Il est en grande partie
complexé au PAI-1.
Le t-PA libre exerce son effet en premier lieu
dans le système vasculaire par la dissolution des thrombi en activant
le plasminogène lié au caillot.
Il est synthétisé principalement
par les cellules endothéliales, et également produit par d’autres
cellules comme les macrophages-monocytes, les mégacaryocytes, les
cellules mésothéliales, les mastocytes, les fibroblastes cardiaques et
les neurones.
De réels progrès dans l’extraction du t-PA ont été
réalisés, après sa découverte en grande quantité dans une lignée
cellulaire du mélanome humain.
Le t-PA recombinant utilisé en
thérapie thrombolytique est produit par génie génétique.
* Structure du t-PA :
La protéine mature existe sous deux formes moléculaires : une forme
native monocaténaire ou sct-PA (single chain t-PA) composée
de 527 acides aminés, et une forme bicaténaire ou tct-PA (two chain
t-PA), obtenue après le clivage de la forme native par la plasmine au
niveau de la liaison Arg275-Ile276.
Le sct-PA n’est pas un zymogène
mais une protéase active.
La molécule de t-PA est formée de cinq domaines, dont quatre sont
situés sur la chaîne A de 36 kDa :
– à l’extrémité NH2-terminale, se trouve une séquence de 38 acides
aminés qui présente une homologie avec le domaine F de la fibronectine, et qui est responsable de sa fixation à la fibrine ;
– une séquence de 49 acides aminés qui présente une homologie
avec l’EGF ;
– deux kringles homologues à ceux du kringle 4 du plasminogène
et de l’urokinase, le kringle 2 se fixe également à la fibrine.
La chaîne B de 32 kDa comprend le domaine catalytique ou
protéasique P qui comporte une séquence de 230 acides aminés.
Le
site actif comprend l’His322, l’Asp371 et la Ser478. Il existe deux
formes différentes de glycosylation.
Le type I est glycosylé en trois
positions Asn117, Asn184 et Asn448 ; le type II, dont la masse
moléculaire est inférieure à 3 kDa, est glycosylé seulement en deux
positions Asn117 et Asn448.
Le type II a une affinité moindre pour
la fibrine et une activité fibrinolytique plus faible que le type I.
* Gène du t-PA :
Le gène du t-PA est localisé sur le chromosome 8 au niveau de la
bande p12-q11.2, sur une longueur de 32,7 kb.
Le peptide signal est
constitué de 20 acides aminés.
Il existe une assez grande similitude
dans l’organisation des gènes de t-PA et de l’u-PA.
Plus de 9 500 paires de bases ont été séquencées dans la région
flanquante en 5’ du gène du t-PA.
Parmi les éléments cis-régulateurs
qui interagissent avec les facteurs de transcription et modulent
l’expression du t-PA, on a identifié trois boîtes TATA, une boîte
CAAT, CREB, CTF/NF, trois Sp1, et trois boîtes GC/GT.
À une
distance de 7 kb en amont du site d’initiation de la transcription, se
trouve une région stimulatrice de transcription (enhancer)
multihormone qui est activée par les glucocorticoïdes, la
progestérone, les androgènes et les minéralocorticoïdes.
Des
descriptions détaillées de ces éléments cis- et transrégulateurs ont
été publiées.
* Anomalies génétiques :
Plusieurs polymorphismes génétiques ont été mis en évidence sur le
gène du t-PA.
L’un d’entre eux, au niveau de l’intron h, est un polymorphisme d’insertion/délétion d’une séquence Alu.
Les
résultats de trois études épidémiologiques sur l’association de ce
polymorphisme avec le risque d’accident cardiovasculaire ont été
contradictoires.
Aucune déficience congénitale de t-PA n’a été décrite dans la
littérature.
Carmeliet et al ont démontré que la destruction du
gène de t-PA ne provoque aucune anomalie macroscopique, et les
souris se développent normalement.
Les études de lyse de caillots
plasmatiques ont démontré une réduction de l’activité fibrinolytique
par rapport à celle des souris sauvages.
La thrombogenèse induite
par des endotoxines chez des souris t-PA–/–, ne provoque pas de
lésions thrombotiques, mais de légères anomalies par rapport aux
souris t-PA + / +.
Cependant, les souris avec une double déficience t-PA–/– et u-PA–/– souffrent de thromboses spontanées sévères et
d’une réduction de la fertilité et de l’espérance de vie.
* Propriétés enzymatiques du t-PA :
Le t-PA agit sur le plasminogène par le clivage de la liaison Arg561-
Val562.
Son activité est potentialisée à la surface de la fibrine par sa
liaison au plasminogène. Le sct-PA se lie plus facilement à la fibrine
que le tct-PA.
En l’absence de fibrine, le tct-PA est 3 à 10 fois plus
actif que le sct-PA. Les inhibiteurs des protéases, et plus
particulièrement le PAI-1, agissent d’une manière plus faible sur le
sct-PA que sur le tct-PA.
En présence de fibrine, ces différences
disparaissent. Deux observations expliquent ce phénomène.
Le sct-PA change de conformation après sa fixation à la fibrine, et le
nombre de sites de faible affinité sur la fibrine est considérablement
plus élevé pour le tct-PA.
En présence de plasminogène, l’affinité du t-PA pour la fibrine est
augmentée de 20 fois environ (Kd = 20 nM) par rapport à celle
obtenue en l’absence de plasminogène.
Cette potentialisation peut
être expliquée soit par la formation d’un complexe ternaire formé
de t-PA, de plasminogène et de fibrine, soit par une plus forte
fixation du t-PA au plasminogène qui s’est fixé préalablement à la
fibrine et a subi un changement de configuration.
Plusieurs auteurs ont trouvé une cinétique enzymatique non linéaire,
plus particulièrement en présence de fibrine.
Ceci n’est pas dû à la
conversion du sct-PA en tct-PA et/ou à la conversion du Glu-plg en
Lys-plg.
Norrman et al ont conclu qu’en présence de fibrine,
l’activation du Glu-Plg par le t-PA comprend une phase initiale (km
= 1,05 µM) et une finale (km = 0,07 µM).
Cette dernière phase
peut être expliquée par la génération de nouveaux résidus lysine au
niveau de l’extrémité C-terminale de la fibrine partiellement
dégradée, résidus qui possèdent une forte affinité pour le t-PA et le
plasminogène.
Sur la fibrine, trois sites spécifiques augmentent la vitesse
d’activation du plasminogène.
Le premier site, appelé FCB-2, se
trouve sur un fragment produit par le clivage de la molécule par du
bromure de cyanogène, et contient la séquence Aa 148-160.
Le
deuxième site se trouve dans la séquence Aa 392-610 et le troisième,
appelé FCB-5, correspond à deux fragments c 311-336 et c337-379
qui sont liés par un pont disulfure.
Les trois séquences sont
dissimulées dans la molécule de fibrinogène, et s’exposent pendant
sa conversion en fibrine.
Les fragments Aa 148-160 et Aa 392-610
fixent le plasminogène et le t-PA, alors que le fragment c 311-379 ne
fixe que le t-PA.
Une étude récente a montré que le t-PA est capable d’activer le FVII,
et peut ainsi exercer une activité procoagulante.
* Propriétés non enzymatiques
:
Le t-PA exerce un effet anti-inflammatoire et stimule la prolifération
des cellules endothéliales.
L’aprotinine est sans effet sur ces
mécanismes, qui sont indépendants de l’activité protéolytique du
t-PA.
* Régulation
:
Le t-PA stocké dans des vésicules spécialisées des cellules
endothéliales et neuroendocrines est libéré par deux voies : une voie
constitutive et une voie régulée.
En ce qui concerne la voie
constitutive, les concentrations du t-PA varient énormément au cours
des 24 heures.
L’activité du t-PA est faible au cours de la nuit et tôt
le matin, puis elle augmente de trois fois environ pendant la
journée.
Une stimulation prolongée et modérée de l’activité
fibrinolytique constitutive est obtenue avec les stéroïdes
anabolisants, et plus particulièrement le stanozolol.
Dans la voie régulée, le t-PA est libéré en quelques minutes sous
l’action d’une grande variété de stimuli extracellulaires, comme la
bradykinine, l’histamine, l’acétylcholine, l’adrénaline, le PAF,
l’endothéline et l’ionophore A23187.
Ces produits induisent un
flux calcique à l’intérieur des cellules endothéliales, et activent une
protéine G couplée aux récepteurs.
Parmis les agents
bêta-adrénergiques, l’isoprotérenol augmente la concentration
plasmatique de t-PA d’une manière dose-dépendante.
En
revanche, la phényléphrine, un agent alpha-adrénergique, augmente le taux de t-PA par diminution du flux sanguin hépatique, entraînant
une réduction de la clairance du t-PA.
L’exercice physique
intense, le stress et l’anxiété provoquent une augmentation du t-PA
par des stimulations alpha- et bêta-adrénergiques et de la vasopressine.
La
vasopressine et son analogue, le DDAVP (1-désamino-8-D-arginine
vasopressine) stimulent la libération de t-PA, probablement via le
recepteur V2.
Au cours des années 1980 et 1990, le DDAVP a
été utilisé dans l’évaluation du potentiel fibrinolytique induit par la
libération de t-PA chez des patients ayant des thromboses veineuses
profondes (TVP) idiopathiques.
L’effet de l’alcool sur le système
fibrinolytique est controversé.
Certaines études ont démontré une
stimulation de la synthèse de t-PA et de l’u-PA dans les cellules
endothéliales humaines de la veine saphène, après une brève
exposition (moins de 30 minutes) à l’alcool à faible concentration
(inférieure à 0,1 %).
Une consommation accrue d’alcool augmente
la libération de t-PA antigène, contrebalancée par une forte libération
de PAI-1.
L’application d’une occlusion veineuse, à une pression intermédiaire
entre la pression sanguine systolique et diastolique, provoque une
sécrétion locale de t-PA.
La quantité de t-PA libérée après une
occlusion veineuse au niveau de l’avant-bras est comprise entre 0,5
et 1,1 ng/mL.
Après une occlusion au niveau de la jambe, le t-PA
libéré est 10 fois plus faible.
Cette sécrétion plus faible au niveau
des extrémités inférieures est probablement due à la pression
hydrostatique.
En effet, l’occlusion veineuse pendant 20 minutes
chez des patients immobilisés provoque une forte libération de t-PA
après une dizaine de jours de repos, par rapport à celle observée au
début de l’immobilisation.
La plus faible production de t-PA au
niveau du mollet contribuerait à l’incidence élevée des thromboses
veineuses profondes (TVP) des membres inférieurs.
* Métabolisme
:
Le t-PA libre ou complexé est éliminé rapidement de la circulation.
Il se lie à une variété de récepteurs membranaires des cellules
endothéliales et des hépatocytes.
Chez un individu normal, la
clairance du t-PA est très rapide (3,5 minutes) si le taux de PAI-1 est
faible, et elle est plus lente (5,3 minutes) si le taux de PAI-1 est élevé.
Ceci peut être expliqué par une clairance plus lente du complexe t-PA/PAI-1, qui est de 5 minutes.
Dans les cirrhoses du foie, la
clairance métabolique du t-PA est diminuée, ce qui augmente le taux
de t-PA dans le plasma.
* Mutants du t-PA et leurs interactions avec les serpines :
Dans le plasma, le t-PA est en grande partie complexé au PAI-1 qui
est légèrement en excès.
Le PAI-1 agit plus facilement sur le tct-PA
que sur le sct-PA.
Le remplacement des trois arginines en positions
298, 299 et 304 par des alanines aboutit à un mutant qui est inhibé
beaucoup moins rapidement par le PAI-1 que le t-PA natif.
Ces
études ont permis d’obtenir de nouveaux mutants de t-PA, comme
le ténectéplase (TNK-t-PA) dont les acides aminés Lys296-His297-
Arg298-Arg299 sont remplacés par quatre alanines.
Il existe d’autres
mutants du t-PA, tous éliminés moins rapidement que le t-PA natif :
le rétéplase (rPA ; délétion des domaines en doigt et EGF), le
lanotéplase (nPA, SUN 9216 ; délétion des domaines en doigt et EGF
et substitution de l’Asn 117 par une Gln), le montéplase (E6010 ;
substitution de la Cys84 par une Ser), et le pamitéplase (YM 866 ;
délétion du kringle 1 et substitution de l’Arg275 par une Glu).
Tous
ces mutants ont été utilisés dans des essais cliniques par injection en bolus, grâce à leur demi-vie beaucoup plus élevée que le t-PA
natif.
* Récepteurs du t-PA :
Les récepteurs du t-PA peuvent êtres classés en deux groupes
fonctionnels distincts ; un groupe qui intervient dans l’activation du
plasminogène en plasmine, et un autre groupe qui intervient dans
l’élimination du t-PA.
Le premier type de récepteurs localise le t-PA
à la surface des cellules, et intervient dans l’activation du
plasminogène en plasmine. Parmi ces récepteurs, on trouve
l’annexine II de 42 kDa, l’actine de 45 kDa, l’héparane sulfate, la
chondroïtine sulfate, la cytokératine 8 et 18 et la tubuline.
Chez
certains patients atteint de leucémie promyélocytaire, la plus forte
expression d’annexine II est associée à un état hyperfibrinolytique.
Le deuxième groupe de récepteurs comprend le récepteur
du mannose et la LRP (lipoprotein related protein)/récepteur
de l’alpha2-macroglobuline.
+ Récepteur du mannose
:
Chez l’animal, il a été démontré que la fixation du t-PA aux cellules
hépatiques et aux cellules de Kupffer est inhibée par l’ovalbumine.
La vitesse d’élimination du mutant de t-PA déficient en Arg117 (qui
est un site de glycosylation par le mannose) est faible.
Le t-PA a une
plus forte affinité pour ce récepteur (kd = 1 à 4 nM) que les autres
glycoprotéines comme la ribonucléase B, la bêta-glucuronidase et
l’ovalbumine (kd = 60 à 600 nM).
L’administration d’estradiol à des
souris provoque une forte expression du récepteur du mannose, et
augmente la clairance du t-PA.
+ Récepteur LRP :
C’est une glycoprotéine de 600 kDa formée de 4 525 acides aminés.
Elle intervient dans la clairance de l’apoprotéine E, des toxines, des
cytokines, des complexes alpha2-macroglobuline/protéases, de t-PA libre
ou complexé au PAI-1, et du complexe u-PA/PAI-1.
Ce processus
est inhibé par une protéine de 39 kDa appelée RAP (receptor
associated protein).
Comparé au t-PA libre, le complexe
t-PA/PAI-1 est éliminé au moins dix fois plus rapidement par le
récepteur LRP.
La glycoprotéine 330 et le récepteur de 130 kDa des lipoprotéines de
très faible densité (VLDL) sont aussi capables d’éliminer le t-PA libre
ou complexé au PAI-1.
L’inhibition des récepteurs du mannose et
de LRP diminue la clairance du t-PA de 10 fois environ.
3- Activation du plasminogène facteur XII-dépendante :
interaction de la phase contact de la coagulation
avec la fibrinolyse
L’activité fibrinolytique d’un plasma déficient en facteur XII, en
prékallikréine (PK) et en kininogène de haut poids moléculaire
(KHPM) est faible.
Inversement, l’addition de sulfate de Dextran ou
de kaolin au plasma normal entraîne un raccourcissement du temps
de lyse des euglobulines isolées à partir de ce plasma.
Au cours
d’une lésion endothéliale, il est probable que la phase contact
s’active localement par l’interaction du facteur XII avec le sousendothélium,
générant du facteur XII activé (XIIa) qui est capable
d’activer directement le plasminogène et la kallikréine qui peut
convertir le scu-PA en tcu-PA.
La kallikréine et les facteurs XIa, XIIa
et le fragment b du facteur XIIa sont à l’origine de l’activité
fibrinolytique facteur XII-dépendante.
Le système est autocatalytique puisque la plasmine, comme la
kallikréine, permet la transformation du facteur XII inactif en facteur
XII activé.
4- Activation de la fibrinolyse d’origine leucocytaire
:
Il existe également une activité fibrinolytique dans les éléments
figurés du sang comme les leucocytes.
Ces protéases conduisent à
des produits de dégradation du fibrinogène différents de ceux
produits par la plasmine.
Les principales enzymes leucocytaires
douées de cette activité fibrinolytique sont l’élastase et la cathepsine
G, d’un poids moléculaire respectif de 28 et 30 kDa.
