Le système immunogénétique human leucocyte antigen (HLA) fait
partie d’un ensemble génétique complexe, noté complexe majeur
d’histocompatibilité (CMH), localisé chez l’homme sur le bras court
du chromosome 6 (bande 6p21.3).
La reconnaissance des premières
molécules HLA à partir de 1952 par Dausset, prix Nobel de
médecine en 1980, représente le point de départ d’une extraordinaire
épopée scientifique et médicale.
Ce système HLA joue, par le biais
de nombreuses molécules, un rôle capital dans la réponse immune.
La diversité structurale, ou polymorphisme, de ces nombreuses
molécules et leur spécialisation expliquent la diversité fonctionnelle
observée et donc les implications cliniques variées de ce système
HLA.
Celui-ci contribue largement à la différenciation du soi et
du non-soi, d’où son rôle en transplantation d’organes et en greffe
de moelle, mais aussi dans le développement d’une réponse à des
éléments peptidiques (étrangers ou autologues) immunogènes, et ce
dans certaines circonstances.
C’est ainsi que les molécules HLA,
selon différents mécanismes, jouent un rôle quelquefois
prépondérant de facteur génétique de susceptibilité ou de résistance
à de nombreuses maladies.
Enfin, il apparaît plus récemment que
ces molécules HLA jouent aussi un rôle dans l’immunosurveillance
antitumorale.
Au plan méthodologique, les techniques d’analyse de la diversité
HLA et des réponses humorales ou cellulaires à ces molécules HLA
atteignent des degrés de résolution et de sensibilité extrêmes en
utilisant les outils les plus modernes de la biologie.
Les données
obtenues éclairent toujours plus le rôle immunologique majeur de
ce système HLA, dont l’équivalent est retrouvé chez tous les
vertébrés.
Généralités sur le système :
A - HLA
HISTORIQUE :
Dès 1954, la technique, peu sensible, de leucoagglutination sur lame,
a permis à Dausset la mise en évidence d’un nouveau système
antigène-anticorps de groupes sanguins (groupe leucocytaire).
La
publication du premier antigène, désigné MAC, de ce nouveau
système fut suivie de l’identification de nombreux autres antigènes
par une nouvelle technique sérologique appelée la « lymphocytotoxicité
(LCT) complément-dépendante » (1964).
La
compréhension de la génétique de ce système complexe, comprenant
plusieurs séries alléliques (notamment HLA-A, -B, -C, -DR, -DQ,
-DP) rangées en deux classes principales (classe I et classe II), fut le
travail de 30 ans d’efforts collaboratifs internationaux (workshops-
HLA) depuis 1965.
À partir du milieu des années 1980, l’avènement
et la maîtrise progressive des techniques de biologie moléculaire du
gène, ainsi que la parfaite définition des structures moléculaires ont
permis une meilleure compréhension fonctionnelle de ce système.
B -
CARTOGRAPHIE
:
Les premières cartes chromosomiques du CMH de l’homme ont
bénéficié des travaux faits chez la souris (système H-2), de
l’observation de familles informatives avec recombinaisons
chromosomiques, d’étude de populations, de techniques de cultures
de cellules de mammifères (technique des hybrides cellulaires
somatiques).
Ainsi furent précisées les notions génétiques
essentielles propres à ce système : localisation sur le bras court du
chromosome 6 chez l’homme (bande 6p21.3), et ordre des principaux
gènes HLA du télomère vers le centromère (HLA-A,-C, -B, -DR, -DQ
et -DP).
Les méthodes plus fines de la biologie moléculaire
moderne ont conduit à des cartes toujours plus détaillées de cette
région de 4 000 kb correspondant au CMH de l’homme.
Schématiquement, ce CMH comporte trois régions riches en gènes.
Celles-ci sont notées, du télomère vers le centromère, région de
classe I (abritant notamment les gènes HLA dits « classiques » de
classe I : HLA-A, -B et -C) s’étirant sur quelque 2 000 kb ; région de
classe III (abritant des gènes apparentés ou non HLA, mais dont un
grand nombre est impliqué dans la réponse immune, tels les gènes
codant certaines protéines du complément C2, C4, Bf, ou certaines
cytokines) couvrant une longueur de 1 000 kb ; enfin, la région de
classe II (abritant des gènes DR, DQ et DP) sur une longueur de
1 000 kb.
La première séquence complète et la carte génique du CMH de l’homme ont été récemment publiées (1999).
Au total,
224 gènes ont été identifiés, mais seulement 128 seraient exprimés.
Une fonction immunitaire est attribuée à 40 % de ces gènes
exprimés.
C - NOMENCLATURE :
Devant l’accumulation des données et en raison de la diversité
(polymorphisme) de ce système, un comité de nomenclature
internationale définit régulièrement des règles strictes d’écriture.
Celles-ci permettent de référencer clairement les régions géniques
(loci), les allèles (ou gènes), les produits (ou antigènes) HLA propres
à ce CMH.
Des équivalences avec d’anciennes désignations sont
également précisées.
D’une façon générale, chaque spécificité
moléculaire HLA est désignée par une lettre précisant le locus
auquel elle appartient (HLA-A pour locus A) suivie par son numéro
spécifique (par exemple HLA-alpha2, HLA-bêta27).
Pour le locus C, et afin
d’éviter toute ambiguïté avec les protéines du complément, la lettre
« w » (pour workshop) est accolée à C (par exemple HLA-Cw2).
Il est
également encore d’usage de mentionner, pour certains antigènes,
la spécificité « large » (broad) à laquelle elle appartient
sérologiquement.
Ainsi, les deux spécificités antigéniques alpha25 et alpha26
furent officiellement reconnues en 1972 comme une subdivision de
la spécificité « broad » alpha10, identifiée depuis 1970.
Cette information
est alors précisée de la façon suivante : alpha25(10) ou alpha26(10).
Ceci est
le cas de nombreuses autres spécificités à chaque locus.
On distingue
la nomenclature des antigènes (définis par sérologie et/ou technique
cellulaire), qui répond aux règles ci-dessus, de celle des gènes
(allèles) codant ces produits antigéniques.
Dans cette dernière, un
allèle est référencé par le locus auquel il appartient suivi d’un
astérisque (*), puis de deux chiffres (incluant le 0 quand nécessaire),
pour désigner la spécificité allélique (par exemple HLA-A*03, HLAB*
35).
Ces deux premiers chiffres sont identiques, sauf rares
exceptions, à la spécificité antigénique correspondante.
Enfin, pour
préciser encore le variant allélique d’un allèle donné, deux chiffres
supplémentaires sont utilisés (par exemple HLA-B*2705).
D - PARTICULARITÉS DE CE SYSTÈME
:
Plusieurs caractéristiques rendent ce système de groupes
remarquable.
La diversité (ou polymorphisme) qui porte sur le
nombre de séries (ou locus) et pour chaque série sur le nombre de
marqueurs spécifiques est la plus exemplaire.
Ainsi, au minimum,
six séries alléliques HLA (-A, -B, -C, -DR, -DQ, -DP) et
800 marqueurs sont individualisés, qui pourraient conduire à rendre
unique, en théorie et en dehors des situations familiales, chaque être
humain.
Chaque individu héritant, à chaque série, de deux gènes
(l’un du père, l’autre de la mère), le nombre de combinaisons
possibles dépasse les 10 milliards !
La réalité est quelque peu
différente.
Ainsi, dans une population géographique donnée, les
fréquences des marqueurs HLA peuvent être très variables.
Chez les
Caucasoïdes, le gène HLA-A*02 est présent chez environ 21,5 % des
sujets de la population, contre seulement 0,8 % pour le gène HLAA*
34 dans cette même population.
D’autre part, pour un même gène HLA-A*11, par exemple, la fréquence varie de plus de 30 % en
Thaïlande à moins de 0,5 % chez les sujets noirs d’Afrique.
Un autre
point caractéristique est lié à la proximité de ces loci dans une même région chromosomique de 4 Mb (4 000 kb).
Ce fragment
chromosomique, haplotype, est transmis en bloc à la descendance.
Chaque individu se caractérise ainsi par deux haplotypes HLA,
provenant l’un du père et l’autre de la mère.
Ces deux haplotypes
définissent le génotype de l’individu.
Exemple de génotype (A, B, DR, DQ) et convention d’écriture :
HLA-A2, B44, DR1, DQ5/alpha30, B44, DR4, DQ7
ou encore :
L’expression codominante de tous ces gènes permet
l’identification des molécules correspondantes et
l’établissement d’un groupage HLA ou phénotype HLA, noté ainsi :
HLA-alpha2, 30 ; B44 ; DR1, 4 ; DQ5, 7
Ce phénotype fait apparaître une hétérozygotie aux loci A, DR et
DQ et une homozygotie B44 au locus B, puisqu’une seule spécificité
est identifiée.
Seule l’étude familiale et le génotype qui en est déduit
permettent d’affirmer cette homozygotie.
La transmission en « bloc » des haplotypes connaît de rares
exceptions dues, lors des méioses, à des recombinaisons
chromosomiques ou crossing-over entre loci, de fréquences variables
mais d’autant plus élevées que les loci concernés sont éloignés.
La
fréquence de cette recombinaison entre les deux chromosomes 6 (du
père ou de la mère) est de l’ordre de 0,8 % entre les loci HLA-A et -B
et conduit à l’apparition d’un nouvel haplotype dit « recombinant ».
Ce taux de « recombinants » observés a longtemps représenté une
unité de mesure de distance génique (exprimée en centimorgans
[cM]) entre loci.
Enfin, une dernière particularité génétique de ce système, due à
plusieurs causes possibles (effet fondateur, sélection au cours de
pandémies…), se traduit par la surabondance de certaines combinaisons
d’allèles de plusieurs loci conduisant à l’enrichissement d’un
haplotype donné dans une population.
Ainsi, l’haplotype alpha1-B8 est
observé dans les populations européennes de l’Ouest avec une
fréquence de 0,0672, alors que le calcul théorique, prenant en compte
les fréquences de ces deux allèles, donne une valeur attendue de
0,0136, correspondant au produit des fréquences alpha1 et B8
(alpha1 = 0,142 X B8 = 0,096).
La différence (ou D) est appelée
« déséquilibre de liaison » (linkage).
Ces fréquences (géniques et haplotypiques) varient selon les groupes ethniques considérés et
sont régulièrement réévaluées dans le cadre d’études collaboratives
internationales (workshop-HLA).
Le plus souvent, le déséquilibre de
liaison est positif, avec un excédent d’haplotypes observés.
Il peut
être négatif lorsque l’haplotype considéré et observé est en défaut
par rapport au calcul théorique.
Ces déséquilibres de liaison peuvent
porter sur l’haplotype complet, entre deux loci extrêmes comme
HLA-A et -DP.
Dans la partie Ouest de la France, l’haplotype
associant alpha29, B44(12), DR7, DQ2 et DP11 en constitue un
exemple.
E - TRANSMISSION GÉNÉTIQUE :
Les gènes HLA sont donc transmis génétiquement en bloc, par haplotypes entiers, des parents aux enfants.
Chacun de ces gènes est
autosomique dominant.
Dans un couple, les deux haplotypes paternels (a, b) et les deux haplotypes maternels (c, d) peuvent se
conjuguer en donnant quatre combinaisons haplotypiques
différentes de fréquences statistiques identiques, soit 25 % (ac = ad
= bc = bd = 0,25).
Le cinquième enfant correspond à un sujet recombinant,
avec un haplotype nouveau (noté c/d) d’origine maternelle.
Structure biochimique des molécules
et gènes HLA :
Les molécules exprimées à la surface cellulaire sont regroupées en
deux classes principales (dites classe I et classe II).
Celles-ci
correspondent à des différences de structures.
A - MOLÉCULES ET GÈNES HLA DE CLASSE I
:
Des caractéristiques biochimiques et fonctionnelles permettent
d’individualiser deux groupes distincts de protéines codées par une
famille mutigénique de 17 séquences apparentées.
1- Molécules et gènes HLA de classe I dits « classiques »
:
Ces gènes HLA-A, -B, et -C codent la chaîne lourde (a) des
molécules de classe I (44 kDa), associée de manière non covalente, à la surface
de la quasi-totalité des cellules, à la bêta2 microglobuline
(bêta2m), chaîne dite « légère » de 11,5 kDa.
La chaîne lourde a compte
une partie intracytoplasmique, une partie transmembranaire et une
partie extracellulaire composée de trois domaines (alphalpha1, alpha2 et alpha3).
La
structure tridimensionnelle de ce type de molécules HLA de classe I
classiques est connue depuis 1987 et explique le rôle fonctionnel
de ces molécules dans la présentation de peptides aux lymphocytes
T.
Les gènes de classe I classiques se composent de huit parties
codantes (exons) séparées par sept introns non codants.
L’exon 1 correspond à la région 5’ non traduite et au peptide signal,
l’exon 8 correspond pour partie à la région 3’ non traduite, les exons
2, 3, 4, 5, 6, 7 et une partie de l’exon 8 codent chacun une séquence
de la chaîne lourde, respectivement de l’extrémité NH2 distale alphalpha1 à
la partie intracytoplasmique carboxylique proximale.
Ces gènes, et
donc les molécules correspondantes, sont extrêmement polymorphes
pour chacune des trois séries alléliques -A, -B et -C.
On dénombre
ainsi respectivement plus de 120, 250 et 70 séquences nucléotidiques
différentes (allèles) pour ces trois séries.
Ce polymorphisme de
séquence est concentré dans trois zones, dites « hypervariables »,
localisées dans les exons 2 et 3 et donc dans les parties
correspondantes distales alpha1 et alpha2 de la molécule.
2- Molécules et gènes HLA de classe I dits
« non classiques » :
Les gènes HLA-E, -F et -G, identifiés à la fin des années 1980, codent
des structures moléculaires très proches des précédentes.
La
distribution tissulaire restreinte, la régulation d’expression différente
et le polymorphisme beaucoup plus limité les différencient des
molécules classiques.
L’architecture de ces molécules également
associées à la bêta2m est pourtant identique.
Au plan fonctionnel, il
n’est pas exclu que certaines molécules puissent présenter des
antigènes.
Néanmoins, quelques modifications dans la structure des gènes E, F
et G conduisent à quelques différences structurales, dont un
raccourcissement plus ou moins important de la partie intracytoplasmique de ces trois molécules.
De plus, l’existence
possible d’épissages alternatifs d’un ou deux exons conduit à la
transcription de plusieurs isoformes différentes. Ainsi, cinq
isoformes membranaires ou solubles sont possibles pour HLA-G.
3- Molécules et gènes HLA apparentés aux classes I :
Les gènes MIC identifiés au voisinage du locus B présentent une
homologie de séquence de 20 à 30 % avec les gènes de classe I
classiques.
Seuls deux, MICA et MICB, sont exprimés, avec une
distribution cellulaire limitée (cellules épithéliales) et un
polymorphisme assez élevé.
MICA ne s’associe pas à la bêta2m et peut
s’exprimer en l’absence de fixation de peptide.
Plus récemment (1996), un gène candidat de l’hémochromatose, noté HFE (et non HLA-H comme initialement proposé), a été localisé à
plus de 4 Mb de la région HLA, en position télomérique par rapport
à HLA-A.
Ce gène code une chaîne lourde homologue à celle des
molécules de classe I, qui s’associe à la bêta2m.
Ce gène joue un rôle
prépondérant dans la régulation d’absorption du fer. Deux
mutations principales de ce gène, et donc de la molécule
correspondante (dont C282Y), sont associées à 70 à 90 % des cas
d’hémochromatose.
Il est intéressant de noter que la mutation C282Y
abolit la liaison de la chaîne lourde avec la bêta2m, réduisant
probablement la capacité de fixation de cette protéine HFE au
récepteur de la transferrine.
C - MOLÉCULES ET GÈNES HLA DE CLASSE II :
Au plan structural, les molécules de classe II sont, comme les
molécules de classe I, des hétérodimères faits de deux chaînes
protéiques notées a et b.
Ces deux chaînes sont codées par des gènes
HLA différents (A et B) situés dans la région dite « de classe II ».
Il
n’existe donc pas d’association avec la bêta2m.
1- Molécules et gènes HLA de classe II dits
« classiques »
:
Ces molécules appartiennent aux trois séries notées HLA-DR, -DQ
et -DP.
Ainsi l’on distingue les molécules DR, DQ et DP constituées
de deux chaînes (a et b), codées par les gènes correspondants notés
DRA et DRB, DQA et DQB, DPA et DPB.
La structure tridimensionnelle d’une molécule HLA-DR1,
déterminée par cristallographie et diffraction aux rayons X, est
similaire à celle d’une molécule de classe I.
Au niveau génomique,
la réalité est un peu plus complexe car il existe, en raison de
duplication génique, de nombreux gènes ne codant pas
(pseudogènes) ou codant des chaînes b supplémentaires dans le cas
de certains haplotypes, particulièrement dans la sous-région DR.
Ainsi, selon les individus, on distingue, au niveau de l’expression
membranaire, plusieurs molécules de classe II possibles :
– molécules DR (DRB1, DRB3 ou DRB4 ou DRB5) : elles
correspondent à l’expression des gènes DRA (codant une chaîne a
quasiment invariable), DRB1 (gène très polymorphe), et dans
certains cas à l’expression des gènes, DRB3, ou DRB4, ou DRB5
(chacun codant une chaîne b plus ou moins polymorphe, capable de
s’associer à la chaîne DRa) ;
– molécules DQ : elles correspondent à l’expression des gènes DQalpha1
et DQB1 des deux haplotypes ;
– molécules DP : elles correspondent à l’expression des gènes DPalpha1
et DPB1 des deux haplotypes.
Les gènes DQalpha2, DQbêta2, DQB3 et DPalpha2, DPbêta2 sont des pseudogènes, sans produits d’expression.
Cette pluralité moléculaire est le fruit de combinaison de chaînes
(a et b) synthétisées par des gènes portés par le même haplotype
(molécules normales dites « de ciscomplémentation »).
Cependant,
des molécules dites « hybrides », fruits de l’association de chaînes
(a et b) synthétisées par des gènes portés par les deux haplotypes
(molécules hybrides de transcomplémentation), ont été rapportées
chez la souris, puis chez l’homme.
Ces molécules hybrides
ajoutent encore plus de diversité HLA et pourraient expliquer d’une
part la susceptibilité accrue de certains sujets (hétérozygotes) à
certaines maladies comme le diabète, et d’autre part l’avantage
sélectif des sujets hétérozygotes HLA, hypothèse proposée dès
1975 et confirmée à partir de 1991.
2- Molécules et gènes HLA apparentés aux classes II :
Deux molécules HLA-DO et HLA-DM, complémentaires dans leur
fonction et répondant à une structure protéique hétérodimérique
sont également codées par des gènes HLA de classe II,
respectivement DOA (anciennement noté DNA) et DOB d’une part,
DMA et DMB d’autre part.
Ces deux structures moléculaires DO et
DM ne sont pas exprimées à la surface cellulaire mais à la membrane
des compartiments endosomiques intracellulaires.
Elles
interviennent toutes deux dans la présentation des peptides par les
molécules HLA de classe II classiques, dont elles partagent environ
25 % d’homologie de séquences.
HLA-DM participe indirectement à
la sélection des peptides présentés, et HLA-DO régule l’activité de
HLA-DM.
Expression tissulaire, régulation
d’expression et molécules HLA
solubles :
A - EXPRESSION TISSULAIRE :
1- Molécules de classe I classiques (HLA-A, -B, -C) :
Ces molécules sont exprimées sur la quasi-totalité des cellules
nucléées de l’organisme.
Néanmoins, des variations quantitatives
sont notables. Les cellules lymphoïdes, les lymphocytes T et B, les
cellules dendritiques, les macrophages sont parmi les plus riches en
molécules de classe I, ainsi que les épithéliums et les endothéliums
vasculaires.
Certains tissus expriment peu ces molécules (thyroïde,
pancréas, muscle cardiaque) ou de manière indétectable (cornée,
neurones) ou très variable (hépatocytes).
Les globules rouges
matures n’expriment pas de molécules HLA de classe I ou seulement
de très faibles quantités de certaines spécificités (HLA-alpha28, -B7 et
B17).
Les réticulocytes sont HLA de classe I positifs.
Les plaquettes
sanguines sont riches en molécules de classe I probablement
adsorbées à partir du plasma, puisque l’on trouve des molécules
HLA solubles dans le plasma.
D’une façon générale, les molécules HLA-C sont quantitativement moins exprimées que les produits
HLA-A et -B.
2- Molécules HLA-E, -F, -G
:
Les gènes codant ces produits sont transcrits en faible quantité, et
les produits correspondants ne sont pas toujours exprimés ou
détectables à la surface cellulaire.
HLA-G est bien exprimé par
les cellules du cytotrophoblaste extravilleux mais pourrait l’être
aussi par d’autres tissus.
Pour HLA-E et -F, de faibles quantités de
protéines peuvent être détectées dans le cytoplasme.
Dans le cas
particulier d’HLA-E, le chargement en peptides particuliers (issus
de molécules de classe I classiques) permettrait son expression à la
surface cellulaire.
Cette expression d’HLA-E protégerait la cellule
d’une lyse par des cellules natural killers (NK).
3- Molécules HLA de classe II :
Ces molécules sont exprimées de manière plus restreinte que celles
de classe I.
Elles sont décelables principalement à la surface des
lymphocytes B et des cellules monocytaires, macrophagiques et
dendritiques qui sont toutes des cellules capables de présenter des
peptides antigéniques aux lymphocytes T (cellules présentatrices de
l’antigène ou CPA).
Les précurseurs hématopoïétiques des globules
rouges et des granulocytes sont de classe II positifs, puis se
négativent.
Certains tissus sont également riches en molécules HLA
de classe II (endothéliums vasculaires, glomérules rénaux…).
Enfin,
il est admis que ce sont les molécules DR qui sont le plus
représentées à la surface cellulaire par rapport aux molécules DQ et
DP.
4- Modulation de l’expression tissulaire :
Cette expression cellulaire naturelle des molécules HLA de classes I
et II peut être grandement modulée par les interférons ou d’autres cytokines de la réaction inflammatoire.
Les interférons augmentent
significativement l’expression des molécules de classe I, ainsi que le tumor necrosis factor (TNF)a.
Ces facteurs peuvent aussi agir sur des
cellules de classe II négatives pour leur permettre une expression de
classe II.
B - RÉGULATION D’EXPRESSION, DÉFAUTS D’EXPRESSION
ET DÉFICITS IMMUNITAIRES :
Les mécanismes de régulation d’expression et de transcription des
gènes sont communs aux deux classes I et II et font intervenir à la
fois des séquences régulatrices en amont des gènes de structures et
des protéines spécifiques dont l’interaction conduit à la régulation
de la transcription des gènes.
Quelques polymorphismes de
séquence dans ces régions promotrices de la transcription de gènes
HLA expliquent certains défauts d’expression de molécules HLA.
Le défaut d’expression peut, selon l’étiologie, concerner l’ensemble
des antigènes de classe I ou II, ou encore un antigène de classe I
ou II isolément.
Les causes de non-expression sont diverses et peuvent aussi être
le fait d’autres gènes dont les produits sont indispensables à
la conformation tridimensionnelle de la molécule ou codant des
facteurs contrôlant la transcription des gènes HLA.
Ainsi l’on peut distinguer plusieurs situations.
1- Non-expression ou faible expression
des molécules HLA de classe I
:
* Absence de transporteurs de peptides ou TAP :
Six cas ont été décrits où l’absence d’expression de l’ensemble des
molécules de classe I est due à un défaut des gènes TAP1 ou TAP2
codant le transporteur de peptides TAP.
La transmission est
récessive, les patients issus de mariages consanguins présentant le
défaut de manière homozygote.
Le transporteur des peptides n’étant
pas fonctionnel, les peptides du cytosol ne peuvent entrer dans le
réticulum endoplasmique ni être chargés par les molécules de
classe I.
Celles-ci n’ont pas alors la structure tridimensionnelle
attendue, restent bloquées entre le réticulum endoplasmique et le cis-Golgi, et seules 1 à 3% des molécules de classe I chargées par
des peptides indépendants du transporteur de peptides sont
exprimées à la surface cellulaire.
Le tableau clinique est évocateur : les patients, sains pendant les
premières années de leur vie, souffrent à la fin de l’enfance
d’infections bactériennes pulmonaires très sévères rappelant la
mucoviscidose.
Certains présentent en plus des ulcères cutanés.
Ces
patients ont néanmoins une synthèse d’anticorps antiviraux et
antibactériens normaux et des lymphocytes T-CD8 sont présents,
bien que leur nombre absolu soit diminué.
* Absence d’un facteur non défini à ce jour :
Trois cas ont été décrits dans lesquels un défaut de transcription
réduisait de dix fois le nombre de l’ensemble des molécules HLA de
classe I.
Le défaut génétique et le mode de transmission ne sont
pas connus.
Cependant, le gène n’est pas présent sur le chromosome
6 puisque les membres de la fratrie atteints ne sont pas HLA-identiques.
Les individus porteurs de ce défaut sont sains et la
découverte du déficit est fortuite.
* Allèles nuls de classe I :
La non-expression d’un seul allèle HLA de classe I chez un individu,
alors que l’expression des autres allèles de classe I est normale, est
la conséquence d’un défaut du gène HLA portant cet allèle.
Ces
allèles sont notés dans la nomenclature officielle par la lettre « N »
(nul).
Ils peuvent résulter :
– d’une substitution d’un nucléotide, dans un exon générant un
codon stop (A*0215N, A*0232N, A*2409N, B*1526N) ;
– d’un décalage du cadre de lecture consécutif à une délétion de
nucléotide(s) dans un exon ou un intron (A*0105N, A*6811N,
B*0808N, N*1501102N), ou consécutif à une insertion de
nucléotide(s) (A*0104N, A*2411N, A*2611N, B*5111N) ;
– de la délétion d’un codon impliqué dans un pont disulfure
(A*0303N).
Les individus présentant ces allèles nuls sont sains. Ils sont à
considérer comme ne portant pas l’antigène en question.
* Allèles faiblement exprimés de classe I :
La faible expression d’un allèle HLA de classe I isolé chez un
individu alors que l’expression des autres allèles HLA de classe I est
normale, est la conséquence d’une mutation sur le gène HLA portant
cet allèle.
Ceci est le cas d’un allèle HLA-A*02 présentant une
substitution dans la région promotrice du gène et d’un allèle A*2402,
où une substitution dans l’intron 2 amène à un épissage anormal.
Les individus présentant ces allèles sont sains et sont à
considérer comme portant l’antigène en question.
2- Non-expression des molécules HLA de classe II :
*
Défaut de régulation de la transcription des gènes de classe II :
Environ 70 malades ont été décrits présentant un défaut
d’expression de l’ensemble des molécules HLA de classe II (DR, DQ,
DP, DM) et de la chaîne invariante Ii (CD74).
Contrairement aux
déficits d’expression de classe I, c’est le tableau clinique alarmant
qui oriente vers le diagnostic (infections gravissimes dès les premiers
mois de la vie à type de septicémies, infections gastro-intestinales,
pulmonaires et urinaires récurrentes qui évoluent inexorablement
vers la mort).
La majorité des patients ont une agammaglobulinémie
et une diminution du nombre absolu des lymphocytes CD4+.
La
transmission familiale est récessive et n’est pas liée au chromosome
6, les patients d’une même famille étant HLA différents. Bien
que le tableau clinique soit homogène, l’étiologie ne l’est pas.
* Allèles nuls de classe II :
Comme pour la classe I, la non-expression d’allèles HLA de classe II
isolés a été notée.
Le nombre d’allèles de classe II nuls est moins
important que pour la classe I et il s’agit d’allèles codés par les gènes
DRB4, DRB5 et DPB1.
C - MOLÉCULES HLA SOLUBLES :
La présence de molécules HLA solubles autologues a été signalée
dès 1970 dans la fraction des bêtalipoprotéines du sérum d’individus
normaux.
Sa source est triple : relargage des molécules exprimées à
la surface cellulaire, épissage anormal (sans partie
transmembranaire) et sécrétion d’une forme soluble (sans partie
transmembranaire et intracytoplasmique).
La quantité d’antigènes
solubles est corrélée au phénotype HLA de l’individu.
Ainsi, les
individus HLA-alpha23, -alpha24, -alpha29 et -alpha33 ont des quantités de
substances solubles plus importantes que les individus ne portant
pas ces antigènes.
À l’inverse, HLA-alpha2 serait associé à une faible
sécrétion.
Les substances solubles de classe I ou II trouvées dans le
sérum sont aussi présentes dans d’autres sécrétions de l’individu
(urine, sueurs, larmes...).
En pathologie, leur présence est augmentée
dans les infections et les maladies inflammatoires mais diminuée
dans les cancers.
Après transplantation d’organes, des molécules
HLA solubles du donneur sont rapidement détectées chez beaucoup
de receveurs.
Le rôle de ces molécules dans la régulation immune et
la tolérogenèse est confirmé.
Cependant, selon la source des
molécules solubles (relarguées ou sécrétées), leurs fonctions
pourraient être opposées (antigéniques pour les premières,
tolérogènes pour les secondes).
Méthodes d’identification
du polymorphisme
:
Schématiquement, deux approches d’identification de ce
polymorphisme HLA sont possibles.
La première consiste à
identifier les molécules à la surface des cellules qui les expriment dans des tests qui utiliseront ces cellules comme support de
l’antigène.
En pratique, ces techniques sont dites sérologiques,
cellulaires ou biochimiques.
La deuxième approche, plus récente
(milieu des années 1980), consiste à identifier les gènes HLA au
niveau de l’acide désoxyribonucléique (ADN) génomique des
cellules.
Ces techniques sont dites de biologie moléculaire des gènes
HLA ou techniques ADN, et permettent la description d’un
polymorphisme quantitativement plus important.
A - IDENTIFICATION DU POLYMORPHISME
DES PRODUITS HLA EXPRIMÉS :
1- Techniques sérologiques
:
À la technique princeps de leucoagglutination utilisée à la fin des
années 1950, a succédé la technique de micro-LCT, publiée par
Terasaki et McClelland en 1964.
C’est la technique de référence,
dite « LCT complément-dépendante ».
Elle nécessite des cellules
lymphocytaires viables, isolées le plus souvent du sang périphérique
par séparation sur gradient de densité (Ficoll).
Cette population de
lymphocytes (Ly) totaux peut être utilisée telle quelle après
ajustement en concentration cellulaire pour des typages HLA de
classe I.
Pour des typages HLA de classe II, une séparation des Ly T
et des Ly B est nécessaire et seule cette dernière population est
utilisée.
Ces cellules sont utilisées réparties dans les puits de
microplaques contenant chacun un anticorps anti-HLA de spécificité
connue (ou quelquefois un mélange limité de spécificités).
Ces
anticorps sont des réactifs de typages sélectionnés, issus du sérum
de sujets allo-immunisés (grossesses, transfusions ou greffes).
Ces
anticorps sont rarement monospécifiques et plus souvent des
mélanges.
De plus, du fait des modalités de la génération du
polymorphisme HLA, un anticorps peut reconnaître plusieurs
spécificités HLA porteuses d’un même enchaînement d’acides
aminés (épitopes).
Plus récemment, sont utilisés des anticorps
monoclonaux polymorphiques, qui présentent l’avantage d’être
constants en réactivité et spécificité.
Ces réactions sérologiques cellules-sérums (ou antigène-anticorps) sont visualisées, après
addition de complément de lapin (titré et sélectionné), par la lyse ou
non des Ly et l’incorporation en cas de lyse d’un colorant vital (bleu
trypan, éosine…) ajouté en fin de réaction.
La complexité de
l’interprétation est liée à de nombreux paramètres (richesse et
viabilité cellulaires, disponibilité et qualité des anticorps, réactions
croisées entre épitopes…).
Elle est plus délicate encore pour un
typage HLA de classe II.
Ces techniques restent des actes réservés
de biologie médicale.
2- Techniques biochimiques :
Elles ne sont pas utilisées en routine pour les typages HLA.
L’isoélectrofocalisation (IEF) nécessite un typage sérologique
préalable HLA de classe I.
Elle a permis de définir des variants non
détectables sérologiquement, par les différences de charges
électriques d’acides aminés, objets de mutation.
De même, pour les antigènes HLA de classe II, en particulier DR et
DQ, un radiomarquage, une précipitation par des anticorps
monoclonaux sélectionnés et une électrophorèse bidimensionnelle
ont permis d’identifier un polymorphisme lié à la fois au poids
moléculaire et à la charge de ces molécules.
Néanmoins, ces
techniques lourdes à mettre en oeuvre sont longues et difficiles à
standardiser et ne peuvent pas être considérées comme de véritables
techniques de typage et d’identification du polymorphisme HLA.
3- Techniques cellulaires :
La découverte de la région de classe II et de ses marqueurs, notés
dans un premier temps HLA « D », est le fait d’une technique
cellulaire : la culture mixte lymphocytaire (ou MLC) (1964).
L’intensité de la réaction de prolifération cellulaire observée lors de
la culture in vitro d’un mélange de populations lymphocytaires,
issues de deux sujets non apparentés, est fonction de leur disparité
HLA de classe II.
De nombreux travaux collaboratifs ont permis de
standardiser, sur la base de la technique de culture mixte
lymphocytaire, une méthode de typage cellulaire de classe II,
réservée à quelques applications cliniques ou travaux de recherche.
Encore faut-il préciser que le typage de classe II obtenu traduit un
ensemble de disparités pour les marqueurs DR-DQ
principalement et DP accessoirement.
De ce fait, il fut noté
« typage de la région “D” », avec une nomenclature spécifique de
marqueurs HLA-Dw qui n’est plus utilisée aujourd’hui.
Lors de cultures mixtes positives (prolifération) en raison des
disparités des marqueurs de classe II entre les deux populations
cellulaires, il peut être noté, en cas de disparités additionnelles des
marqueurs de classe I, la production de cellules T cytotoxiques.
Ces
clones T de cellules ont pu être utilisés dans des tests cellulaires
complexes dits « de cytotoxicité à médiation cellulaire » (CML). Ces
tests ont permis d’identifier des variants de spécificités de classe I,
comme par exemple pour HLA-alpha2 ou HLA-bêta27.
De ces techniques d’identification des molécules HLA, seules les
techniques sérologiques de cytotoxicité complément-dépendante
sont utilisées en routine.
Néanmoins, leur niveau de discrimination
entre antigènes, la nécessité de disposer de sérums anti-HLA et de
cellules viables en quantité suffisante, expliquent le recours fréquent
aux techniques de typage par biologie moléculaire des gènes.
B - IDENTIFICATION DU POLYMORPHISME DES GÈNES HLA
:
1- Historique : approche « restriction fragment length
polymorphism »
Le clonage intensif et progressif des gènes HLA de classe I (1980) et
de classe II (1982) a permis l’obtention de clones d’ADN
complémentaires et génomiques pour l’utilisation secondaire de
sondes HLA.
Celles-ci ont pu être utilisées dans des réactions
d’hybridation avec des ADN génomiques à étudier, permettant une
étude de polymorphisme de loci ou d’allèles.
Ces premières
techniques de typage HLA par biologie moléculaire ADN étaient
basées sur l’analyse du nombre et de la taille de fragments d’ADN
hybridés à la sonde spécifique HLA, après coupure (digestion)
enzymatique sélective de l’ADN cellulaire.
Cette technique dite
restriction fragment length polymorphism (RFLP) ou polymorphisme
de longueur des fragments de restriction, utilise la méthode de
transfert sur membrane.
Son application au typage HLA fut l’objet
principal du workshop-HLA 1987 (Princeton, New York) et permit
des progrès importants, notamment dans la définition et l’étude du
polymorphisme de classe II, appliquées à la compatibilité HLA
en transplantation d’organes.
Cette technique RFLP fut aussi la
première à permettre une identification du polymorphisme HLA-DP
sans le recours à des techniques cellulaires et une mesure de l’impact
des incompatibilités DP dans la culture mixte lymphocytaire.
Elle
a permis aussi une réévaluation de bon nombre d’associations HLAmaladies,
précisant même les données comme dans le cas de
l’immunisation antiplaquettaire foetomaternelle.
Cette technique de typage HLA est aujourd’hui abandonnée, en
raison de ses obstacles techniques (radioactivité et durée) et de ses
limites d’informativité et de précision du polymorphisme.
2- Technique par réaction d’amplification en chaîne
:
L’introduction et la publication d’une technique d’amplification
génique délimitée ou réaction de polymérisation en chaîne
(polymerase chain reaction [PCR]) a révolutionné toutes les
approches d’étude de gènes, du clonage au séquençage, en passant
par l’étude du polymorphisme.
Cette technique PCR a augmenté la sensibilité, la spécificité et la
simplicité des méthodes d’étude des gènes.
Elle implique la
succession de cycles (une trentaine en général) comportant chacun
trois étapes :
– dénaturation de l’ADN double brin à tester en ADN monobrin à
94 °C ;
– accolement des amorces ou primers, spécifiquement sélectionnées
et délimitant la zone génique à amplifier ;
– extension à partir de ces amorces, c’est-à-dire copiage du brin
matrice par action de l’enzyme Taq-polymérase thermostable avec
incorporation progressive mais rapide des nucléotides mis en excès
dans le milieu réactionnel.
Au total, après 30 cycles, l’augmentation exponentielle du nombre
de copies conduit à l’obtention d’environ 1 x 106 copies de gènes.
Selon le positionnement des amorces, la séquence amplifiée peut être
très spécifique ou non.
Ainsi, on définit habituellement deux types
d’amplifications :
– la PCR dite « générique » : les deux primers de délimitation de
zone à amplifier sont positionnés dans des zones conservées non
polymorphes ;
– la PCR dite « spécifique » : l’une des amorces (voire les deux) est
sélectionnée quant à sa zone de complémentarité de séquence pour
ne s’hybrider qu’avec une séquence déterminée spécifique d’un
allèle ou d’un groupe d’allèles (PCR spécifique d’allèle ou PCR
« spécifique de séquence » [PCR-SSP]).
On comprend tout l’intérêt de cette technique PCR dès lors que sont
connues les séquences des différents allèles à évaluer.
La sélection
des amorces permet l’amplification d’un fragment d’un gène qui est
identifié dans un second temps.
À ces variantes opératoires portant sur l’amplification elle-même,
s’ajoutent des variantes portant sur l’identification du produit
d’amplification.
Ainsi, on distingue au moins trois groupes de
méthodes utilisant :
– des oligosondes spécifiques d’allèles ou de séquences (PCR-SSO)
marquées radioactivement ou par des enzymes ;
– la digestion du fragment d’amplification : PCR-RFLP ;
– l’électrophorèse pour révéler la présence ou l’absence de produits
d’amplification des réactions de PCR-SSP.
Ces techniques de PCR ont permis de remarquables progrès dans
l’identification du polymorphisme des gènes HLA de classe II et ont
conduit à la mise en évidence d’une extrême diversité allélique,
notamment pour DRB1 et DPB1.
Le polymorphisme de classe I reste
plus difficile à identifier par ces techniques PCR en raison de la
richesse en pseudogènes coamplifiables dans cette région classe I et
de la répartition dans deux, voire trois exons, de ce polymorphisme
de séquences.
Les techniques PCR sont désormais utilisées en routine dans les
laboratoires d’histocompatibilité.
Elles nécessitent une parfaite
connaissance de l’immunogénétique HLA et de sa nomenclature
pour une interprétation rigoureuse des résultats obtenus.
La précision des typages alléliques (quatre digits) est indispensable
dans la sélection de donneurs de moelle non apparentés.
Ces
techniques de PCR-SSP ou PCR-SSO ne permettent pas toujours une
telle précision, du fait de certaines combinaisons d’allèles pour les
deux haplotypes.
Ces ambiguïtés de typages alléliques dues à
l’étendue et à la nature du polymorphisme ne peuvent alors être
résolues que par une technique de séquençage d’allèles.
3- Séquençage :
Le séquençage de gènes donne les informations les plus précises
dans son application au typage HLA.
Basée sur l’analyse par
séquençage d’un fragment de gène amplifié par PCR, la technique
dite sequencing based typing (PCR-SBT) utilise également un logiciel
pour comparaison de la séquence étudiée à celles déjà connues.
Cette technique peut être réalisée rapidement, à l’unité, en moins de
48 heures, et donne des résultats sans équivoque si le produit
amplifié est pur de toute contamination par coamplification.
Le choix des amorces d’amplification est en effet primordial.
Le
séquençage permet de résoudre les difficultés de typage (ambiguïtés)
rencontrées avec la technique PCR-SSP chez des sujets hétérozygotes
porteurs de deux allèles de séquences voisines.
Sur un plan
technique, cette technique reste basée sur la synthèse enzymatique
de fragments d’ADN.
Le terme PCR-SBT regroupe des approches méthodologiques
variées.
Les différences portent sur le matériel biologique utilisé
(ADN génomique, acide ribonucléique messager [ARNm]), sur la
stratégie d’amplification, sur les gènes (classe I ou classe II) et les
régions (deux ou plusieurs exons) amplifiés, et enfin sur la
méthodologie (manuelle ou automatique).
Actuellement, plusieurs
stratégies automatisées existent qui utilisent des réactifs de
séquençage et des marquages fluorescents différents.
La technique PCR-SBT, recommandée dans la sélection HLA
définitive de donneurs de moelle apparentés, est appliquée aussi
bien aux gènes HLA de classe I qu’aux gènes de classe II.
Elle permet également d’identifier de nouvelles séquences alléliques
qui sont par la suite référencées, et devrait également être utile dans
la compréhension de certaines associations HLA-maladie, en
précisant les séquences nucléotidiques impliquées.
