Introduction :

L’hémostase primaire est le processus qui permet le colmatage d’une lésion vasculaire.

Elle aboutit à la formation d’un clou plaquettaire ou thrombus blanc.

Elle fait intervenir à la fois des systèmes cellulaires les plaquettes, les cellules endothéliales, les autres cellules sanguines et des composants protéiques fixés au sousendothélium ou circulants.

Les conditions hémodynamiques jouent aussi un rôle primordial : l’importance des modalités d’écoulement du sang au niveau de la paroi vasculaire dans la genèse du thrombus est maintenant bien établie.

Le fibrinogène et le facteur Willebrand, que l’on retrouve à la fois dans le plasma, les plaquettes, les cellules endothéliales et le sous-endothélium, sont indispensables dans les étapes d’adhésion et d’agrégation plaquettaire.

Les plaquettes ont un rôle central dans l’hémostase du fait de leur interaction avec le vaisseau, mais aussi par leur participation au processus de coagulation, de la fibrinolyse et de la rétraction du caillot.

En pratique, l’exploration de l’hémostase primaire se résume essentiellement à l’exploration des fonctions plaquettaires et du facteur Willebrand.

Numération plaquettaire :

Elle reflète l’équilibre entre la production médullaire et la destruction périphérique.

La numération plaquettaire normale est comprise entre 150 et 400 G/L.

Le sang prélevé par ponction veineuse franche est recueilli dans des tubes contenant un anticoagulant, l’éthylène diamine tétra-acétique (EDTA).

Tout résultat de numération plaquettaire inférieur à la normale impose un contrôle sur lame pour rechercher la présence d’agrégats plaquettaires.

Il n’est pas rare en effet que l’EDTA induise la formation in vitro d’agrégats, responsables d’une fausse thrombopénie.

Le diagnostic est alors facilement redressé grâce à un comptage sur tube citraté (tube à vitesse de sédimentation [VS]) ou au bout du doigt (Unopettet).

Les compteurs électroniques ont l’avantage de permettre la mesure simultanée de multiples paramètres difficiles à apprécier à l’oeil.

On obtient en particulier le volume plaquettaire moyen et un histogramme de la distribution du volume plaquettaire qui peuvent avoir un intérêt diagnostique dans certains cas.

Temps de saignement :

Le temps de saignement classique, par la méthode d’Ivy, est un test global qui doit être réalisé dans des conditions très rigoureuses.

Il n’a aucun intérêt lorsque le nombre des plaquettes est inférieur à 50 G/L.

S’il n’est pas prédictif du risque hémorragique, il garde un intérêt dans le dépistage des thrombocytopathies, essentiellement constitutionnelles.

Il n’est plus prescrit à titre systématique dans le bilan préopératoire, mais reste utile pour le diagnostic des thrombocytopathies et de certaines formes de la maladie de Willebrand.

Cependant la sensibilité de ce test est insuffisante : un temps de saignement normal ne permet pas d’exclure les formes modérées de ces maladies.

De plus, la reproductibilité est médiocre, même entre des mains expérimentées. Les techniques recommandées actuellement sont bien standardisées.

La technique d’lvy en trois points est désormais supplantée par la technique d’lvy par incision, qui fait appel à des dispositifs commerciaux. Le test consiste à pratiquer au niveau de l’avant-bras, sous pression constante à 40 mm de mercure, une incision de longueur et de profondeur standardisées.

Les valeurs normales varient selon la technique utilisée et selon l’âge.

Temps d’occlusion (PFA-100y, Dade Behring) :

Le test d’Ivy tend à être remplacé par une technique in vitro, la mesure du temps d’occlusion grâce au PFA-100y (platelet function analyser).

Il est pratiqué chez tout patient ayant des signes ou antécédents hémorragiques avec une numération plaquettaire normale.

Il n’y pas de recommandation précise de ce test dans le suivi des malades sous un traitement antiagrégant plaquettaire.

La mesure du temps d’occlusion est une évaluation rapide et automatisée de la capacité d’activation des plaquettes en sang total et en condition de flux à fort taux de cisaillement.

Cette simulation de l’hémostase primaire est réalisée par l’écoulement forcé de l’échantillon sanguin dans un tube capillaire aboutissant à une membrane couverte de collagène et d’adénosine disphosphate (ADP), ou de collagène et d’épinéphrine.

L’appareil PFA-100y permet de mesurer le débit en fonction du temps et de déterminer le délai nécessaire à l’arrêt de l’écoulement sanguin.

Le test est fortement sensible à la prise d’aspirine (temps d’occlusion allongé sur épinéphrine, normal sur ADP).

Le temps d’occlusion est allongé dans diverses thrombocytopathies (thrombasthénie de Glanzmann, maladie de Bernard et Soulier).

Il s’est révélé particulièrement utile pour le dépistage de la plupart des types de maladie de Willebrand (sauf le type 2N).

Le PFA-100y explore essentiellement l’accrochage de la glycoprotéine GPIb plaquettaire au facteur von Willebrand (vWF), suivi de celui de la GPIIbIIIa au complexe vWF + collagène.

Le test n’est valide que si la numération plaquettaire (> 100 G/L) et l’hématocrite sont normaux.

Des valeurs seuils audelà desquelles on considère le résultat comme pathologique sont données par le fabricant en fonction de la concentration de citrate du prélèvement, mais il est recommandé à chaque laboratoire de définir ses propres valeurs normales.

Malgré son intérêt, cet examen ne peut actuellement être considéré comme pouvant remplacer dans toutes les situations l’étude du temps de saignement par la technique d’Ivy, entre autres parce que l’appareil n’est pas disponible dans tous les laboratoires.

Étude du facteur von Willebrand (vWF) :

La maladie de Willebrand est la plus fréquente des affections hémorragiques constitutionnelles.

Le diagnostic doit être évoqué chez tout patient présentant une histoire hémorragique personnelle ou familiale inexpliquée.

Un temps de saignement et un temps de céphaline activé normaux ne suffisent pas à éliminer ce diagnostic, qui repose essentiellement sur le dosage de l’activité du vWF.

Le dosage de l’activité vWF est habituellement réalisé par une mesure de l’activité cofacteur de la ristocétine, qui dépend de l’affinité du vWF à la glycoprotéine Ib plaquettaire (vWF:RCoF, agglutination de plaquettes ou de membranes plaquettaires en présence de ristocétine et du plasma du malade).

Il peut également être apprécié par sa capacité de liaison au collagène (vWF:CBA, collagen binding assay, dosage Elisa du vWF se fixant sur une matrice de collagène).

Le dosage immunologique du vWF (vWF:Ag) repose le plus souvent sur une technique immunoenzymatique (enzyme-linked immunosorbent assay [Elisa] ou enzyme-linked fluorescent assay [Elfa]). Une technique d’immunoagglutination est également disponible, mais sa sensibilité est moins bonne.

La distribution des taux de vWF:Ag chez les sujets normaux est large (50 à 200 %).

Le taux augmente avec l’âge et il est plus faible chez les sujets de groupe sanguin O.

Le déficit en facteur vWF est le plus souvent quantitatif (le résultat du dosage de l’activité et celui du dosage antigénique sont alors comparables).

Les déficits qualitatifs correspondent aux variants de maladie de Willebrand (environ 20 % des cas) : l’activité biologique est très abaissée par rapport au dosage antigénique (ratio Ag/activité > 2), et dans ces cas le taux d’antigène peut être normal.

Le vWF assure le transport du facteur VIII:C (facteur antihémophilique A).

De ce fait, le taux de facteur VIII doit être mesuré car il peut être abaissé, ce qui explique l’allongement du temps de céphaline activé.

Cependant les taux de VIII sont très variables dans la maladie de Willebrand, diminués ou normaux.

Le variant de type 2A se caractérise par une baisse des multimères de haut poids moléculaire de vWF et une hypoagrégabilité à la ristocétine.

Le variant type 2B correspond à une hyperfixation de la molécule sur la GPIb, et est responsable d’une hyperagrégabilité à la ristocétine avec diminution des multimères de haut poids moléculaire.

Le variant de type 2N est très particulier puisque l’anomalie concerne la fixation du facteur VIII : diminution du taux circulant de facteur VIII alors que les dosages Ag et activité du vWF sont normaux.

Le type 3 est la forme grave de la maladie de Willebrand : le vWF n’est pas détectable et le taux de facteur VIII est très abaissé.

Les anomalies génétiques responsables de la maladie de Willebrand sont multiples et sont en cours d’exploration : les études en biologie moléculaire ne sont pas encore un outil diagnostique.

Ainsi, en présence d’une maladie de Willebrand, l’étude de l’agrégation à la ristocétine en plasma citraté riche en plaquettes à de faibles et fortes concentrations (ristocetin-induced plateletagregation [RIPA]), la mesure de l’affinité pour le facteur VIII, l’analyse de la distribution des multimères par électrophorèse en gel d’agarose et enfin la mesure du taux intraplaquettaire permettront de classer le type de la maladie, ce qui est très important pour définir l’attitude thérapeutique.

Mesure de l’agrégation plaquettaire in vitro :

L’activation plaquettaire par agrégation peut être estimée en calculant simplement le rapport entre le nombre de plaquettes après activation et le nombre initial de plaquettes dans un échantillon fixé par un mélange d’EDTA-formaldéhyde.

De façon plus habituelle, on fait appel à des techniques photométriques qui mesurent le taux d’agrégation en plasma riche en plaquettes, sous l’effet de différents inducteurs.

L’ADP fut le premier inducteur à être utilisé.

Ces techniques ne sont réalisables que si le nombre de plaquettes est supérieur à 100 G/L.

Les plaquettes sont placées en agitation constante à 37 °C.

L’agrégamètre enregistre en continu les modifications de la transmission lumineuse induites par l’agrégation des plaquettes mises en contact avec un agoniste.

Les courbes enregistrées dans les conditions normales sont différentes selon l’agent agrégant utilisé.

Les paramètres déterminés sont le pourcentage total d’agrégation, les vitesses initiale et maximale d’agrégation, ainsi que le temps de latence (paramètre important de l’agrégation au collagène).

En cas d’absence ou en cas d’anomalie fonctionnelle du complexe des glycoprotéines IIbIIIa (thrombasthénie de Glanzmann), les plaquettes perdent leurs capacités d’agrégation à tous les inducteurs sauf à la ristocétine.

L’étude de l’agrégation à la ristocétine est utile pour le diagnostic de la maladie de Jean Bernard et Soulier (absence de GPIb + plaquettes géantes) et pour le typage de la maladie de Willebrand.

Dans les déficits granulaires, on recherchera des anomalies de la sécrétion induite par des agents tels que ADP, épinéphrine et collagène.

Si l’on suspecte une anomalie de la synthèse du thromboxane A2, les plaquettes seront testées en présence d’arachidonate de sodium et d’un analogue des endoperoxydes de prostaglandines (U46619).

Les autres inducteurs utilisés sont le peptide terminal du récepteur de la thrombine après clivage ou TRAP-6 (thrombin receptor activated peptide avec six résidus aminés ou SFLLRN), les 1-O-alkényl-2-Oacétyl- sn-glycéro-3-phosphocholine ou PAF (platelet activating factor), l’ionophore calcique A23187, le phorbol-myristate acétate (PMA).

La technique d’étude de l’agrégation plaquettaire comporte plusieurs variantes : il est possible de travailler sur des plaquettes isolées du milieu plasmatique après filtration sur gel de sépharose ou lavage des cellules par des étapes de centrifugation ; en l’absence de plasma, il devient possible de tester l’agrégation à la thrombine en éliminant les interférences du plasma sur l’agrégation.

Certains agrégamètres permettent de travailler sur sang total par des mesures d’impédance, et ils peuvent aussi être équipés de photomultiplicateurs : ceux-ci sont capables de mesurer la libération plaquettaire de l’ATP par chimioluminescence ou bien les flux calciques intracellulaires en utilisant un fluorochrome adéquat.

Il est désormais possible de suivre de façon continue le processus d’agrégation par mesure de la diffusion laser en fonction de l’évolution de la taille des agrégats, qui devient mesurable en temps réel sur plasma riche en plaquettes ou sur sang total non dilué.

Autres techniques explorant les fonctions plaquettaires :

Elles ne sont pas d’usage courant, et seront réalisées au cas par cas en fonction des résultats préalables de l’agrégamétrie ou bien, comme pour la cytométrie en flux, dans les cas où le volume des prélèvements sanguins est limité.

A - GLYCOPROTÉINES PLAQUETTAIRES :

Les techniques électrophorétiques, qui nécessitent des volumes sanguins importants, ont été supplantées par les techniques de cytométrie en flux.

Celles-ci présentent trois avantages majeurs : il est possible de travailler sur de petits volumes de sang total ; l’analyse est possible même en cas de thrombopénie sévère (contrairement à l’agrégamétrie) ; enfin, si nécessaire, le résultat peut être rendu en urgence, dans l’heure qui suit le prélèvement.

Les anticorps utilisés reconnaissent un épitope normalement présent sur les glycoprotéines plaquettaires, soit au repos : anti-IIb-IIIa (CD41-CD61), anti-Ib (CD42b), anti-Ia-IIa (CD49b-CD31) ; soit après activation : anti-GMP140 (CD62-P), anti-CD63, anti-LlBS/PAC-1, ou un épitope présent sur un ligand qui se fixe sur les plaquettes après activation : anti-RIBS, antifibrinogène, anti-vWF.

Ces techniques en cytométrie sont largement utilisées pour confirmer le diagnostic des thrombocytopathies sévères par anomalies des glycoprotéines de la surface plaquettaire.

B - ADHÉSION :

Il n’existe pas de technique simple permettant d’apprécier l’adhésion des plaquettes au sous-endothélium : le dispositif le plus physiologique est représenté par la chambre de Baumgartner.

Il permet la détermination des plaquettes adhérentes à un sousendothélium d’aorte de lapin en fonction de taux de cisaillement variables par le flux.

Il existe d’autres systèmes permettant la maîtrise des taux de cisaillement comme le cone-platelet analyser : en fonction de la vitesse de rotation, l’enregistrement par caméra permet l’analyse en fonction du temps.

Ce type d’appareil utilise une matrice où les différents composants du sous-endothélium peuvent être fixés de manière contrôlée.

Les techniques de rétention plaquettaire aux billes de verre ont été abandonnées.

Pour mesurer l’adhésion au collagène, des tests sur colonne de sépharose ou sur filtre été proposés, l’agrégation plaquettaire étant inhibée en travaillant à pH acide ou sur EDTA.

C - SÉCRÉTION :

L’évaluation de la sécrétion plaquettaire in vitro repose sur diverses méthodes : dosage de la b-thromboglobuline, mesure de l’excrétion de la sérotonine marquée au 14C, mesure par réaction de bioluminescence de la quantité d’ATP libérée par la plaquette, dosage de mépacrine incorporée aux granules denses par fluorimétrie ou cytométrie en flux.

On peut également apprécier l’expression de la GMP-140 (CD-62P) des granules a à la surface plaquettaire par la cytométrie en flux.

D - MÉTABOLISME PLAQUETTAIRE :

Pour comprendre certains mécanismes physiopathologiques, il peut être utile d’explorer le métabolisme plaquettaire ; ces tests sont réservés à des laboratoires spécialisés :

– mesure des variations de concentrations intracellulaires du Ca2+ par des sondes fluorescentes (Indo-1, Fluo-3, Calcium-Green) ;

– exploration du métabolisme de l’acide arachidonique radiomarqué par analyse en chromatographie des lipides plaquettaires ;

– mesure des variations du taux d’AMPc intraplaquettaire par des techniques Elisa ;

– étude des phosphorylations des protéines plaquettaires.

L’indication de ces explorations reste exceptionnelle pour mieux comprendre certaines thrombopathies concernant des anomalies de l’activation et de la signalisation intracellulaire.

E - AUTRES RÉCEPTEURS PLAQUETTAIRES :

Les techniques classiques pour déterminer la densité des récepteurs plaquettaires (purinocepteurs, récepteurs des catécholamines, prostanoïdes, adénosine, hydroxytryptamine, vasopressine, PAF, thrombine) et leur affinité aux agonistes et antagonistes demandent l’utilisation de radioligands.

Elles peuvent se réaliser sur plaquettes lavées ou filtrées et sur membranes plaquettaires.

F - IMMUNOLOGIE PLAQUETTAIRE :

Les plaquettes sont le support de groupes antigéniques spécifiques qui sont le reflet de polymorphismes moléculaires.

Chaque spécificité antigénique unique est désignée sous le terme HPA (human platelet antigen).

Treize systèmes sont actuellement décrits.

Ils peuvent être la cible de processus d’allo-immunisation, responsable de thrombopénies foetomaternelles ou posttransfusionnelles.

Le diagnostic repose sur le typage plaquettaire, réalisé actuellement par la mise en évidence du polymorphisme sur produit d’amplification génique et la recherche d’alloanticorps.

Des autoanticorps peuvent se développer dans les situations de dérèglement immunitaire et au cours du purpura thrombopénique auto-immun (PTAI), les épitopes reconnus étant situés le plus souvent sur le complexe GPIb-IX et IIb-IIIa.

Ces anticorps peuvent aussi induire une thrombopathie.

La présence d’immunoglobulines fixées sur la surface des plaquettes (test de Coombs plaquettaire) n’est pas spécifique et il est préférable de rechercher les autoanticorps spécifiques par des techniques de type MAIPA (monoclonal antibody specific immobilization of platelet antigen) ou western blot.

Cependant, ces techniques ne sont pas toujours indispensables au diagnostic du PTAI.

G - ACTIVITÉ COAGULANTE :

L’activité coagulante des plaquettes correspond à l’activité prothrombinase : un test indirect consiste à doser le facteur II résiduel dans le sérum 24 heures après coagulation.

Un temps de coagulation activé au moyen de PAF et/ou de kaolin peut être mesuré en sang total, de façon automatisée grâce à l’appareil HemoStatusy (Medtronic).

Cette activité peut être mesurée au moyen de substrats chromogènes ou fluorescents après recalcification du PRP et/ou activation plaquettaire.

Elle est aussi dépendante de l’expression de phosphatidylsérine à la surface des plaquettes et de leur capacité à générer des microparticules membranaires exprimant ce même type de phospholipide anionique (FIII ou PF3) : cette particularité est appréciée par le marquage à l’annexine V.

Techniques mesurant l’activation des plaquettes ex vivo :

L’augmentation du taux de b-thromboglobuline (b-TG) permet d’estimer une activation plaquettaire in vivo, mais la mesure de la b-TG plasmatique doit être réalisée avec des conditions de prélèvement très strictes : prélèvement sans garrot, rejet du premier millilitre de sang et recueil du sang sur l’anticoagulant de Ludlam et Cash, conservé à + 4 °C et centrifugé à froid.

Le taux de b-TG est comparé à celui du PF4 ; le ratio b-TG/PF4 doit rester supérieur à 2,3 du fait des clairances de ces molécules.

Un ratio proche de 1 est en faveur d’une activation plaquettaire produite au cours du prélèvement.

La cytométrie en flux permet d’apprécier les modifications du complexe IIb-IIIa après activation (complexe IIb-IIIa activé et fixation du ligand fibrinogène), l’expression membranaire des protéines granulaires (CD62-P), lysosomiales (CD63) ou le clivage de la GPV (qui est aussi mesurable par Elisa dans le plasma) et la liaison des protéines plaquettaires sécrétées comme la thrombospondine.

Ces techniques manquent de sensibilité car les plaquettes activées in vivo ont une durée de vie très courte ; la détermination des agrégats mixtes monocytes-plaquettes serait une meilleure approche.

Les plaquettes activées ont aussi la propriété de relarguer des fragments ou microparticules constituées d’une surface membranaire riche en phospholipide de type phosphatidylsérine ; celles-ci peuvent être recherchées dans le plasma par des techniques de double marquage à l’annexine-V et d’anticorps antiglycoprotéines plaquettaires comme un anti-GPIb (CD41b).

En somme, le diagnostic des thrombocytopathies repose essentiellement sur l’étude de l’agrégation plaquettaire en PRP complétée par une analyse de cytométrie en flux, l’appareil étant facilement accessible dans les laboratoires d’hématologie.

Les autres techniques citées sont davantage utilisées en laboratoire de recherche ou pour une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques.

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