Diagnostic bactériologique d'une infection Cours de Bactériologie
Le diagnostic bactériologique d'une infection :
A - Définitions :
Les bactéries sont classées à partir des données du génome (GC%, séquençage partiel ou total) en grandes familles, en genres et espèces.
Un genre peut comporter plusieurs espèces génétiquement proches.
Exemples : la famille des Vibrionacae, le genre Vibrio, l’espèce Vibrio cholerae ; la famille des Enterobacteriacae, le genre Klebsiella , les espèces Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozenae, Klebsiella oxytoca, et Klebsiella rhinoscleromatis.
On utilise en pratique pour désigner les bactéries uniquement les noms de genre et d’espèce.
Les noms de bactéries s’écrivent en italiques.
En l’absence d’identification précise d’une espèce (ce qui peut arriver sans affecter les décisions thérapeutiques), on utilise la nomenclature sp (espèce non précisée): exemple Klebsiella sp. Chaque espèce est constituée d’une population d’individus appelés souches ou isolats bactériens.
Ces souches présentent des variations phénotypiques (sensibilité aux antibiotiques, tests biochimiques…) et sont définies par un profil génétique de restriction qui leur est propre.
Certaines espèces bactériennes sont oligoclonales, c’est-à-dire qu’elles ne comprennent que très peu de souches, d’autres sont très hétérogènes comprenant beaucoup de souches (hétéroclonales).
L’isolement d’une même souche chez plusieurs patients définit une épidémie.
B - Diagnostic bactériologique
:
La stratégie diagnostic est d’isoler et d’identifier le germe responsable d’une infection à partir des produits pathologiques, et éventuellement de mettre en évidence une réponse immune spécifique du germe suspecté.
Le diagnostic direct :
On cherche d’abord à détecter la bactérie ou ses constituants (protéines, polyosides, acides nucléiques). Il faut ensuite isoler en culture et identifier le genre et l’espèce auxquels appartiennent la bactérie.
La souche isolée pourra être caractérisée par des marqueurs épidémiologiques pour éventuellement la comparer à des souches de même espèce isolées chez d’autres patients, dans le but de reconnaître une épidémie.
Le diagnostic indirect :
Le diagnostic direct peut être complété en détectant la réponse immunitaire spécifique de la bactérie suspectée (anticorps), ce qui donne un argument en faveur du rôle étiologique d’une bactérie, sans toutefois preuve absolue.
C - Prélèvements
:
Les prélèvements des produits pathologiques sont guidés par la symptomatologie et l’examen clinique et doivent être effectués :
1- Le plus tôt possible, avant l'antibiothérapie
2- A la porte d'entrée cutanéo-muqueuse toujours recherchée, dans le sang au cours de la dissémination (bactériémie) et éventuellement dans les organes cibles (LCR, abcès profonds par ponction, épanchements...).
3- De façon stérile et rapidement acheminés au laboratoire
Il existe des prélèvements mono-microbiens, provenant de sites normalement stériles (sang, urine, LCR, tissus...) , et pour cela d’interprétation assez facile.
A l’opposé, il existe des prélèvements polymicrobiens provenant du revêtement cutanéo-muqueux associé à une flore commensale (gorge, selles, vagin, peau).
Le diagnostic est plus difficile, car il faut repérer une bactérie pathogène au milieu de bactéries commensales souvent très abondantes.
D - Diagnostic bactériologique direct
:
L'examen microscopique L'examen microscopique reste un acte fondamental du diagnostic bactériologique .
Il comporte :
1- Un examen en lumière blanche à l’état frais et après coloration : coloration de Gram ( pour la plupart des bactéries médicales), coloration de Ziehl-Neelsen (pour les mycobactéries), coloration à l’argent ( pour les bactéries très fines : tréponèmes, spirochètes…) ;
2- Examen en fluorescence (mycobactéries…)
3- Examen en contraste de phase et au fond noir (pour les bactéries très fines)
L’examen microscopique des produits pathologiques précise :
1- L’abondance et la diversité de la flore bactérienne (monomorphe, polymorphe) ;
2- La forme des bactéries (coques, bacilles, spiralés…), leur taille (1-10 µ), l’association des bactéries entre elles (diplocoques, amas, chaînettes…), leur caractère Gram + ou Gram - (ou mycobactéries, spirochètes…) et leur position intra ou extracellulaire ;
3- L’intensité de la réaction inflammatoire (polynucléaires neutrophiles, hématies, monocytes, lymphocytes).
E - Détection des antigènes solubles dans les produits pathologiques
:
Dans certains cas particuliers, on peut être amené à rechercher des antigènes bactériens directement dans les produits pathologiques.
Les méthodes de détection rapide des antigènes utilisent des anticorps monoclonaux (mAb ), lors de tests dit au latex, ELISA, ou par immunofluorescence.
Par exemple au cours des méningites, on peut détecter en quelques minutes des antigènes de pneumocoques, méningocoques et hémophiles, ou dans les prélèvements génito-urinaires des antigènes de Chlamydia et mycoplasmes.
Ces tests restent peu sensibles et requiert un nombre élevé de bactéries ( > 105-6 / mL).
Isolement et identification en culture
:
Les conditions de culture sont les milieux de culture, la présence ou non d’oxygène et la température d’incubation des bactéries.
A - Milieux de culture
:
La majorité des bactéries croissent in vitro sur milieux de culture ( milieux gélosés et bouillons ) : milieux ordinaires (type gélose trypticase-soja), milieux enrichis (sérum, sang, ascite…), milieux sélectifs (contenant des antiseptiques), milieux liquides d'enrichissement (contenant des antiseptiques ou incubés à une température non permissive pour la flore commensale mais laissant croître certaines bactéries pathogènes).
B - Aérobiose et température
:
Les bactéries sont incubées en aérobie ou anaérobie, ou en présence de C02 ( 5-10%), définissant des bactéries aérobies, anaérobies ou microaérophiles (10% O2 ).
La température d’incubation est habituellement de 35-37°C.
C - Vitesse de croissance
:
1- La vitesse de croissance peut être rapide en 24-48h, (20 min à 60 min de temps de génération pour la plupart des bactéries médicales courantes, telles que staphylocoques, streptocoques, entérobactéries…).
2- Certaines bactéries ont une croissance lente : Mycobacterium tuberculosis (tuberculose) croît en 2-3 semaines (temps de génération 24-48 h).
3- Certaines bactéries ne peuvent être cultivées in vitro (Mycobacterium leprae, Treponema pallidum) et ont un temps de génération très long in vivo chez l’animal de 12-14 jours.
4- Certaines bactéries nécessitent des milieux de culture particuliers leur fournissant les nutriments et les conditions (osmolarité…) nécessaires à leur croissance ( Mycoplasma, Borrelia, Leptospira).
5- Certaines bactéries sont des parasites intracellulaires stricts, comme les virus, et requiert des milieux de culture cellulaire (Chlamydia, Rickettsia, Tropheryma whippelii).
D - Les colonies
:
Pour la plupart des bactéries médicales courantes(staphylocoques,streptocoques, entérobactéries…), des colonies visible à l’oeil nu apparaissent sur la gélose habituellement en 24-48 h.
Chaque colonie correspond à environ 1-2 x 109 bactéries et résulte de la multiplication rapide d’une seule bactérie (‘clonage).
On note l’aspect des colonies, leur taille (1-3 mm), leur éventuelle pigmentation (vert, jaune, rouge…), la présence d’une hémolyse sur gélose au sang.
La suite du processus d’identification part de colonies isolées pour définir les caractères biochimiques d’identification.
E - Identification de l’ espèce bactérienne
:
On identifie la bactérie suspecte dans des produits pathologiques sur des caractères morphologiques, nutritionnelles, respiratoires et biochimiques.
Les caractères morphologiques des bactéries et de leurs colonies :
1- Coque, bacille, bactérie spiralée
2- Bactérie à Gram positif ou négatif, ou non colorable par la coloration de Gram ( Ziehl-Neelsen : mycobactéries…).
- Les exigences nutritionnelles bactérie nécessitant des milieux enrichis (hémine, ascite, sérum, sang ...) et requérant ou non des facteurs de croissance : bactéries auxotrophes (facteurs de croissance : aminoacides, vitamines…) ou prototrophes (croissance sans facteur de croissance).
- Les propriétés de respiration et de fermentation : bactérie aérobie, anaérobie ou aéro-anaérobie, capable de respiration et/ou de fermentation des sucres, utilisation des sucres (fermentation avec ou sans gaz) détectée par les galerie dites API.
- La production d’enzymes (catalase, oxydase, nitrate-réductase, protéases, lécithinases,...).
L’ensemble de ces caractères biochimiques définit le phénotype de la bactérie ou biotype.
F - Identification de la souche
Dans un but épidémiologique, on est amené à préciser l’identité de la souche en cause:
- La constitution antigénique du pathogène : d’après les antigènes du lipopolysaccharide (LPS) pour les bactéries à Gram - , des polyosides capsulaires, des protéines d'enveloppe externe , permettant ainsi le sérotypage par agglutination avec des sérums spécifiques.
- La sensibilité à une batterie de phages permet aussi de définir des lysotypes (lysotypie).
- Les techniques de biologie moléculaire donnent de nouveaux outils épidémiologiques permettant de définir avec la précision des ‘’empreintes digitales’’ la singularité d’une souche bactérienne.
Les techniques les plus utilisées sont électrophorèse en champ pulsé (PFGE), ribotypage et random PCR.
Ces techniques sont très utilisées pour détecter des épidémies.
G - Antibiogramme
:
L’antibiogramme définit in vitro la sensibilité des bactéries pathogènes.
On utilise largement la méthode des disques, qui permet de voir le diamètre d’inhibition de croissance autour des disques imprégnés d’antibiotiques.
Cette méthode standardisée donne de bons résultats en pratique.
Elle peut être complétée par des méthodes plus sophistiquées telles que la détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI) et des concentrations minimales bactéricides.
On définit ainsi un phénotype de résistance naturel ou acquis.
H - Apport des méthodes moléculaires au diagnostic
:
Les méthodes de biologie moléculaire peuvent, dans des situations cliniques limitées, améliorer le diagnostic bactériologique direct.
Ces méthodes sont basées sur la polymerase chain reaction (PCR) qui est utilisée pour détecter des séquences bactériennes spécifiques de certaines bactéries pathogènes.
Les avantages principaux de la PCR sont d’augmenter considérablement la sensibilité de détection des microorganismes et de pouvoir déceler des microorganismes éventuellement non viables.
1- La PCR pour reconnaître des bactéries suspectées par la clinique :
La PCR utilisant des primers spécifiques peut tenter de détecter directement dans les produits pathologiques des fragments de génomes bactériens.
C’est un apport important pour le diagnostic des infections dues à des bactéries à croissance lente, difficile ou impossible :
- Bordetella pertussis, agent de la coqueluche, baille Gram négatif à croissance difficile
- les bactéries à croissance intracellulaire stricts : Chlamydia trachomatis et C pneumoniae responsable d’infections pulmonaires, oculaires et génitales , Rickettsia spp ( agent des typhus), Tropheryma whippeli, agent de la maladie de Whipple
- les mycobactéries de la tuberculose (Mycobacterium tuberculosis, M bovis) et de la lèpre (Mycobacterium leprae)
- les mycoplasmes : Mycoplasma pneumoniae, Ureaplasma urealyticum, (responsables d’infections pulmonaires et génitales).
- Treponema pallidum, agent de la syphilis
La PCR pourrait aussi être utile pour les infections où le diagnostic doit être rapidement établi (méningites), ou pour détecter une résistance aux antibiotiques d’une bactérie à croissance lente, telle que M. tuberculosis.
2- La PCR pour identifier une bactérie inconnue dans les tissus infectés et en culture.
L’amplification de séquences de rDNA utilisant des primers universels ou de certains gènes bactériens (gènes sod de la superoxyde-dismutase, rpoB de la RNA polymérase …) avec des primers spécifiques, peut être utile dans certains contextes cliniques difficiles, tels que les infections torpides des immunodéprimés.
Grâce aux banques de données, on peut identifier une bactérie difficile à classer dans l’arbre phylogénétique.
I - Le diagnostic indirect : détection des anticorps spécifiques
:
Le sérodiagnostic est un appoint au diagnostic direct. Il est très utile dans certains cas.
Les meilleures indications sont :
1- Le diagnostic d’une infection due à une bactérie à croissance difficile ou impossible (Treponema pallidum, Chlamydia, Rickettsia, Leptospira, Borrelia...),
2- Le diagnostic d’infections décapitées par les antibiotiques (antibiothérapie précoce)
3- Le diagnostic rétrospectif d’une infection récente
4- Les études épidémiologiques cherchant à déterminer l’impact d’un micro-organisme sur une population
J - Cinétique de la production des anticorps
:
La valeur du sérodiagnostic est fortement augmentée par la mise en évidence d’ une cinétique de la production des anticorps.
Les anticorps apparaissent en 7-10 j en utilisant les techniques habituelles de détection (agglutination, ELISA…), avec apparition d’IgM spécifiques.
Le pic de production est entre 21 et 30 j, les titres diminuant ensuite pour atteindre un taux résiduel (IgG) après 2-3 mois qui persistera des années.
K - Interprétation du sérodiagnostic
:
On doit donc pratiquer deux tests sérologiques à 15 jours d’intervalle : un sérum le plus précoce possible après le début clinique (souvent négatif), un sérum tardif 15 jours plus tard.
Si ce 2ème test est positif, on parle de séroconversion (apparition d’anticorps spécifiques).
La mise en évidence d’une ascension des titres d’anticorps est aussi un bon signe en faveur d’une infection en évolution (souvent une primo-infection).
Cependant, il faut garder à l’esprit la possibilité de réactions antigéniques croisées fréquentes avec d’autres bactéries.
Le sérodiagnostic est donc un diagnostic de suspicion.
Son interprétation attachera une bonne valeur à la détection d’IgM, d’une séroconversion, ou d’une ascension des titres d’anticorps.
