a) L’analyse génétique chez la levure; les souches
haploïdes ou diploïdes et comment on croise entre elles deux souches haploïdes
pour obtenir un diploïde, puis comment on stimule la méiose pour récupérer
des spores haploïdes en vrac ou en tétrades.
b) L’analyse génétique consiste à étudier les produits de la méiose chez un
hétérozygote issu d’un croisement; chez la drosophile ou la souris, les
produits de la méiose d’une F1 ne peuvent être étudiés qu’à travers l’analyse
d’une F2 obtenue par croisement de la F1 avec elle-même ou avec un
parent récessif (test-cross).
Au contraire, chez la levure, les cellules diploïdes
vont donner, par méiose, des spores haploïdes qu’on peut recueillir et
étudier directement.
c) Le milieu de culture minimum est noté Mo et contient du glucose (source
de carbone et d’énergie), un sel d’ammonium (source d’azote) et des
oligo-éléments.
Quand la source de carbone n’est pas du glucose, elle est
notée entre parenthèses, par exemple Mo(gal) : milieu minimum où la
source de carbone est du galactose (et non du glucose).
Quand un milieu
est supplémenté en un élément dont la souche a besoin pour se développer,
cela est indiqué par un signe +, par exemple Mo + val : milieu minimum
additionné de valine, dans le cas où la souche ne peut la synthétiser ou la
produire (mutant de production ou de synthèse).
d) Il est possible de tester le phénotype d’une souche en la transplantant
sur un autre milieu par la technique de réplique : on prend des cellules dans
la boîte mère et on les transplante dans la boîte test afin de voir si elles s’y
multiplient et donnent des colonies.
Une technique particulière est la
réplique sur velours, par laquelle on procède à une empreinte de la boîte
mère sur un velours, puis on applique ce velours sur la boîte test vierge de
sorte que les cellules de la boîte mère seront déposées selon leur topographie
originelle dans la boîte mère, ce qui permet d’identifier, dans celle-ci,
les colonies qui ne poussent pas sur la réplique.
Cette technique est très
rentable quand la boîte mère contient plusieurs centaines de colonies.
Dans ce problème, on ne se préoccupe pas du signe sexuel des souches ni
des marqueurs de sélection des diploïdes sur les boîtes de croisement.
On
suppose donc, quand on fait un croisement sur une boîte, que les diploïdes
peuvent se former et qu’eux seuls peuvent pousser sur la boîte, à condition
cependant que le milieu soit adéquat compte tenu de leur génotype.
Question
1
On croise entre elles des souches haploïdes de levure, l’une de phénotype
[his+], l’autre de phénotype [his–], incapable d’assurer la synthèse de
l’histidine; les colonies diploïdes sont de phénotype [his+].
Après méiose,
on isole 400 spores à l’origine de 400 colonies testées par réplique sur un
milieu adéquat : 400 poussent sur milieu minimal additionné d’histidine,
182 poussent sur milieu minimum.
1. Sur quel milieu la souche [his–] est-elle entretenue ? Justifier la réponse.
2. Sur quel milieu fait-on le croisement ? Justifier la réponse.
3. À quelle conclusion conduit l’analyse génétique ?
4. Pourquoi est-il inexact de dire que la capacité de synthétiser l’histidine
ne dépend que d’un seul gène ?
Question
2
Deux souches haploïdes de levure, l’une [ura–], l’autre [ura+] sont croisées
entre elles et donne un diploïde [ura+], capable d’assurer la biosynthèse de
l’uracile.
Des cellules qui entrent en méiose, on isole 400 spores mises en
culture sur un milieu minimum, dénommé Mo additionné d’uracile.
Les
400 colonies sont testées par la méthode des repiquages et on dénombre
295 colonies [ura–] et 105 colonies [ura+].
1. Sur quel milieu la souche [ura–] est-elle entretenue ? Justifier la réponse.
2. Sur quel milieu fait-on le croisement ? Justifier la réponse.
3. Sur quel milieu a-t-on répliqué les colonies obtenues sur la boîte de croisement
pour conclure que le phénotype du diploïde est [ura+] ?
4. À quelle conclusion conduit l’analyse génétique ?
Question
3
La souche haploïde de levure A, de phénotype [met–, gal–], incapable de
synthétiser la méthionine et d’utiliser ou métaboliser le galactose, est
croisée avec la souche haploïde B de phénotype [met+, gal+]; on obtient un
diploïde [met+, gal+], capable d’assurer la biosynthèse de la méthionine et
d’utiliser le galactose comme source de carbone et d’énergie.
Des cellules
qui entrent en méiose, on isole 136 spores mises en culture sur un milieu
minimum, dénommé Mo (où la source de carbone est du glucose) additionné
de méthionine.
Des 136 colonies qui y ont poussé on effectue des
prélèvements qu’on repique sur 3 boîtes, différentes, Mo où 70 colonies se développent, Mo(gal) où 37 colonies se développent, Mo(gal) + met où
71 colonies se développent.
1. Sur quel milieu la souche [met–; gal–] est-elle entretenue ? Justifier la
réponse.
2. Sur quel(s) milieu(x) fait-on le croisement ? Justifier la réponse.
3. Sur quel milieu a-t-on répliqué les colonies obtenues sur la boîte de croisement
pour conclure que le phénotype du diploïde est [met+; gal+] ?
4. Compte tenu des résultats obtenus sur les différentes répliques, identifiez
et dénombrez les phénotypes des différents types de spores obtenues.
5. Déterminez, par l’analyse génétique, le nombre de gènes impliqué dans
la variation de chaque caractère et pour combien de gènes les deux souches
diffèrent.
Écrivez leurs génotypes.
Niveau bac-Licence (L1, L2)/ Définition des objectifs
:
– Introduction aux particularités de l’analyse génétique chez la levure.
– Définir un milieu de test d’un phénotype pour en déduire un génotype.
– Tester la dominance, et la ségrégation 2/2 pour un phénotype.
– Discuter l’observation de spores recombinées et anticiper sur l’analyse fonctionnelle
du gène.
Solution
:
Question
1
1. La souche [his–] ne peut synthétiser l’histidine qui doit donc lui être fournie, cet acide aminé
pouvant entrer sans problème à partir du milieu extérieur : celui-ci est donc Mo + his.
2. On ne sait pas si le mutant est dominant ou récessif et si l’hétérozygote formé chez le
diploïde est de phénotype [his+] ou [his–].
Si on veut être certain d’avoir des colonies
diploïdes, le milieu de croisement doit être Mo + his.
3. Pour savoir si les colonies diploïdes obtenues sont [his+] ou [his–], c’est-à-dire si le mutant
est récessif ou dominant vis-à-vis du sauvage, il suffit de faire une réplique sur un milieu Mo
et de voir si on obtient ou non des colonies.
4. Les 400 spores poussent sur Mo + his et seules 182 sont capables de pousser sur Mo, ce
qui signifie que parmi les 400 spores, 182 sont [his+] et, par différence, 218 sont [his–], ce qui
n’est pas significativement différent de 200-200 (on peut faire un test de χ2, voir
exercice 2.1).
Ce résultat est celui qui est attendu si les souches parentales ne diffèrent que
pour un seul gène (attention, elles sont haploïdes : l’une est A et l’autre a) et, qu’en conséquence,
le diploïde issu du croisement (on ne dit pas F1 chez la levure) est hétérozygote A//a
pour ce seul gène.
Dans ces conditions, la méiose, chez ce diploïde, pour ce gène, est le siège d’une ségrégation
2-2 avec deux types de spores (A) et (a) de fréquence ½ – ½, selon le schéma suivant :
Souches croisées [phénotypes] [his–] × [his+]
Souches croisées (génotypes) (a) × (a+)
Génotype du diploïde a+//a
Génotypes des spores (a) (a+)
Fréquences des spores ½ ½
Phénotypes des spores [his–] [his+]
5. Il serait inexact de dire que la biosynthèse de l’histidine, le caractère étudié, ne dépend que
d’un gène dans la mesure où on a seulement montré que la variation de ce caractère chez les
deux souches étudiées ne dépendait que de la variation d’un seul gène, c’est-à-dire un seul
des gènes impliqués dans la biosynthèse de l’histidine; car il est évident que cette biosynthèse,
ce caractère, dépend de plusieurs gènes.
Question
2
1. Le milieu est Mo + ura (justifications, voir question 1)
2. Le milieu est Mo + ura (justifications, voir question 1).
3. Le milieu est Mo (justifications, voir question 1).
4. Si les deux souches différaient pour un seul gène, un seul des gènes impliqués dans la
biosynthèse de l’uracile, la ségrégation 2-2 chez le diploïde conduirait à 50 % de spores
[ura+] et 50 % de spores [ura–], ce qui n’est pas le cas.
Il n’y a
donc pas de ségrégation 2-2 et les souches diffèrent
obligatoirement pour plus d’un gène, donc au moins deux.
Question
3
1. Le milieu est Mo + met, car la souche ne peut produire de méthionine. Il ne faut surtout pas
lui fournir du galactose qu’elle est incapable de consommer, de métaboliser.
2. Le milieu est Mo + met, car on ne sait pas si le phénotype [met–] d’auxotrophie pour la
méthionine est récessif ou dominant.
3. On a fait une réplique sur un milieu Mo pour savoir si le diploïde est [met+], et on y a
obtenu des colonies, et on a fait une autre réplique sur milieu Mo(gal) + met, afin de savoir si
le diploïde est [gal+] et on y a obtenu des colonies.
NB : on teste chaque phénotype séparément car si l’un des deux phénotypes mutés était
dominant, on aurait aucune colonie sur un milieu de réplique Mo(gal).
4. Sur la boîte Mo(gal) on dénombre les 37 colonies qui sont [met+; gal+] parmi les 136.
Sur le milieu Mo, on dénombre les 70 colonies qui sont [met+; gal+ ou –], ce qui, par différence
permet de dénombrer 33 colonies [met+; gal–].
Sur le milieu Mo(gal) + met, on dénombre les 71 colonies qui sont [met+ ou –; gal+], ce qui,
par différence, permet de dénombrer 34 colonies [met–; gal+].
Les colonies [met–; gal–] sont incapables de pousser sur les trois boîtes de répliques et sont
au nombre de (136 – 37 – 34 – 33) = 32.
5. Si on s’intéresse au caractère méthionine, on dénombre 70 colonies [met+] pour 66 colonies
[met–] ce qui est conforme à l’hypothèse d’une ségrégation 2-2 chez le diploïde pour un
couple d’allèles a+ et a d’un gène impliqué dans la biosynthèse de la méthionine et pour
lequel les deux souches parentales diffèrent.
De même, avec 71 colonies [gal+] et 65 colonies [gal–], on peut conclure que les deux
souches diffèrent l’une de l’autre pour un seul des gènes impliqués dans l’utilisation du
galactose.
Enfin, on peut affirmer qu’il ne s’agit pas des mêmes gènes puisqu’il y a des phénotypes
recombinés [met+; gal–] et [met–; gal+] qui n’existeraient pas en cas de mutation pléiotrope.
Le génotype de A peut être écrit ainsi (a; b) et celui de B ainsi (a+; b+).
