L’activité désaminase spécifiée par le gène DEA2 est testable dans le
milieu de culture par un test de coloration : en présence d’un substrat spécifique,
noté S, une colonie de levure DEA2+ est rouge.
Des études enzymatiques
ont montré que les activités désaminase spécifiées par les gènes DEA2
et ADA1 étaient indécelables en cas de concentration intracellulaire importante
en hypoxanthine, notamment sur un milieu additionné d’hypoxanthine.
On dispose des souches (ade10-1, trp1-3, lys2-4) et (met14-5, his2-3),
respectivement de phénotype [ade–, trp–, lys–] et [met–, his–], l’une et l’autre
de signe sexuel matα ou mata.
a. Quel est le phénotype de coloration du mutant (ade10-1, trp1-3, lys2-4)
sur les milieux suivants :
a. À partir de ce tableau, pouvez vous définir, pour la souche (ade10-1, trp1-3,
lys2-4), un crible simple de mutants dea2- ? Est-il possible d’obtenir de tels
mutants à partir de la souche (met14-5, his2-3) ? Justifiez votre réponse.
b. De laquelle des souches précédentes partiriez-vous pour obtenir un mutant
ada1- ?
On ne demande pas de décrire toute la procédure de mutagenèse et de
sélection des mutants mais de justifier votre réponse en précisant le phénotype
qui distinguerait un tel mutant.
Question 3.
À l’issue des études menées précédemment, on dispose d’une souche
haploïde A ayant perdu les fonctions spécifiées par les gènes ADA1 et DEA2
et dont le génotype présumé est noté (ade10-1, dea2-1, ada1-1, trp1-3,
lys2-4, met14-5).
Une culture de la souche A est soumise à l’action d’un agent mutagène avant
d’être étalée sur un milieu minimum Mo, supplémenté en adénine, en tryptophane,
en lysine et en méthionine.
On observe 10 colonies. Ces dix colonies
sont repiquées sur le même milieu additionné du substrat S, trois d’entre
elles forment des colonies rouges.
a. Que peut-on dire à coup sur de ces trois colonies rouges ?
b. Ces trois colonies sont repiquées sur des milieux test adéquats, deux se
révèlent [trp+, lys+, met–], et sont notées RA1 et RA2, la troisième, notée
RA3, se révèle [trp+, lys–, met–], quelle est la conclusion la plus vraisemblable
?
Comment expliquez-vous la différence de phénotype lysine entre
RA3 et RA1 ou RA2 ?
c. Quelles hypothèses peut-on émettre pour les sept autres colonies ?
Question 4.
Les colonies RA1, RA2 et RA3 sont croisées chacune avec la souche
(met14-5, his2-3) puis le diploïde est mis à sporuler afin de recueillir et d’analyser les tétrades pour les phénotypes d’auxotrophie au tryptophane
et à la lysine (tableau ci dessous).
On sait, par des analyses antérieures, que toutes les mutations d’auxotrophie
trp1-3, lys2-4, met14-5 et his2-3 sont physiquement indépendantes
deux à deux et que le gène TRP1 est un marqueur centromérique.
a. Montrez en quoi ces résultats confirme votre interprétation fonctionnelle
de la question 3-a.
b.
Quelles précisions cartographiques apportent ces résultats ? Combien de
gènes au minimum, quelles distances entre gènes, entre gène et centromère ?
Faire un schéma de la cartographie.
Question 5.
Les sept colonies demeurées blanches à l’issue du test de coloration
(voir question 3), notées RA4 à RA10, sont restées mutantes pour les
trois auxotrophies (tryptophane, lysine, méthionine) présentes dans la
souche A.
Une analyse enzymatique in vitro permet d’attester la présence de l’activité
désaminase codée par le gène ADA1 et capable d’assurer la transformation
d’adénosine en inosine.
Une analyse biochimique semble montrer que la chaîne peptidique correspondant
à la protéine du gène ADA1 est présente dans ces sept colonies et
ne semble pas différer de la chaîne peptidique sauvage (on observe le même finger print dans de multiples conditions différentes).
a. En quoi ces observations rendent difficile d’envisager que la souche A
ait été mutée dans le gène ADA1, comme on l’avait imaginé au départ sur la
base d’observations phénotypiques comme celles décrites à la question 2.c
(noter que l’énoncé de la question 3 considère que le génotype de la souche A
n’est que présumé) ?
Quelles sont deux hypothèses simples qu’on pourrait
imaginer pour expliquer la croissance des colonies RA4 à RA10 ?
b. On dispose d’un autre mutant, noté B, de génotype (ade10-1, dea2-1,
ada1-2, trp1-3, lys2-4, met14-5) à partir duquel on obtient un révertant chez
lequel la chaîne peptidique spécifiée par ADA1 diffère de la chaîne peptidique
sauvage pour plusieurs acides aminés contigus; précisez en quoi
cette observation atteste que la souche B est bien mutée dans le gène ADA1
et la nature de la mutation ada1-2.
c. Le mutant A, dont le génotype présumé avait été noté (ade10-1, dea2-1,
ada1-1, trp1-3, lys2-4, met14-5) est croisé avec une souche (ade10-1, dea2-1,
ada1-2, his2-3) sur milieu minimal Mo additionné d’hypoxanthine; deux
observations sont réalisées :
– les colonies qui apparaissent se révèlent incapables de pousser par réplique
sur un milieu minimal additionné d’adénine;
– les diploïdes donnent, après méiose, des tétrades dont l’analyse pour le
phénotype de croissance sur adénine donne les résultats suivants : 18 tétrades
avec 2 spores [ade–] et 2 spores [ade+], 12 tétrades avec 3 spores [ade-]
et une spore [ade+] et 17 tétrades avec 4 spores [ade–].
En quoi ce résultat est il en faveur d’une des deux hypothèses simples
formulées précédemment ?
NB : dans cette question les phénotypes [ade+] et [ade–] indiquent la capacité
ou l’incapacité de pousser sur adénine (et non comme classiquement
la capacité ou l’incapacité de la synthétiser); en effet les souches utilisées
sont toutes ade10-1.
➤ Niveau L3-Prépa-Master :
Solution
1. En l’absence du produit du gène ADE10, la chaîne de synthèse de l’adénine est interrompue,
ce qui conduit non seulement à une carence en adénine, mais aussi à une carence en
AMP, en IMP et en GMP, puisque la synthèse d’IMP apparaît comme un point central à
toutes ces chaînes.
L’apport d’adénine permet la production d’AMP, d’IMP via l’hypoxanthine, soit directement
par l’enzyme codée par DEA2, soit via l’AMP, puis l’adénosine et l’inosine, par l’enzyme
codée par ADA1.
L’apport d’hypoxanthine permet la synthèse directe d’IMP, puis la formation d’adénine via
l’AMP et l’adénosine.
2. a. Phénotype de coloration de la souche (ade10-1, trp1-3, lys2-4) sur les milieux suivants :
b. Il suffit de partir de mutants ade10-1 et d’étaler, après mutagenèse, sur milieu supplémenté
en lysine + tryptophane + adénine et additionné de S pour recueillir les colonies blanches; les
mutants ainsi obtenus ne peuvent pousser sur adénine que grâce à la fonction du gène
ADA1 mais sont blancs car l’activité spécifiée par DEA2 est absente.
Le crible ainsi défini est
un crible positif.
Il est possible et aussi facile d’obtenir des mutants dea2- à partir de la souche (met14-5, his2-3)
qui, étant DEA2+, donne des colonies rouges sur milieu supplémenté en méthionine et en
histidine, additionné de S et dont le mutant dea2- sera capable de pousser sur le même milieu
mais donnera des colonies blanches par déficit de l’enzyme spécifié par le gène en question…
si sa quantité est suffisante chez DEA2+ pour permettre la coloration.
c. Il faut partir de la souche (ade10-1, trp1-3, lys2-4) devenue (ade10-1, dea2-, trp1-3, lys2-4)
à la suite du crible défini à la question précédente.
Alors, par un crible négatif, on peut
obtenir des mutants incapables de pousser sur adénine (car ils ne peuvent plus produire
d’IMP) mais capables de continuer à pousser sur hypoxanthine (ils produisent l’IMP directement
et l’adénine via l’AMP et l’adénosine).
Le phénotype de tels mutants est donc de ne « pas pouvoir pousser sur adénine et de pouvoir
pousser sur hypoxanthine, sachant qu’ils sont mutés, par perte de fonction, dans les deux gènes
ADE10 et DEA2 ».
En effet, sans ces deux mutations préalables, on ne dispose d’aucun
critère phénotypique permettant d’identifier, donc de sélectionner, de tels mutants.
3. La souche étudiée est (ade10-1, dea2-1, ada1-1, trp1-3, lys2-4, met14-5), elle pousse sur
milieu supplémenté en hypoxanthine mais ne peut pousser sur adénine car ne dispose pas des
fonctions des gènes DEA2 et ADA1.
Les 10 colonies obtenues, capables de pousser sur adénine, sont des révertants capables de
former de l’hypoxanthine à partir d’adénine ou, en tout cas de former de l’IMP.
a. Les trois colonies rouges, en présence de S, sont obligatoirement des révertants ayant
recouvrer la fonction du gène DEA2 puisque l’activité désaminase spécifiée par ce gène est
requise pour utiliser le substrat spécifique S qui donne la coloration.
b. Cette conclusion est confortée par ce résultat. En effet on peut considérer que ces révertants
ayant aussi retrouver la prototrophie pour un ou même deux acides aminés, sont des
révertants par suppresseur informationnel, ce qui signifie que les mutations dea2-1 trp1-3 et
lys2-4 sont des mutations STOP de même nature, dont l’effet (d’interruption de la traduction)
peut être supprimé par le même ARN-t suppresseur.
Cependant, chez RA3, l’ARN-t suppresseur
agit sur dea2-1 et trp1-3 mais pas sur lys2-4, alors que les mutations sont du même type,
sans doute parce que l’ARN-t suppresseur apporte un acide aminé compatible au niveau des
chaînes peptidiques des deux premiers gènes mais incompatible au niveau de la chaîne peptidique
codée par le gène LYS2 (qui sera inactive et/ou mal conformée et/ou instable).
c. Les sept autres colonies n’expriment pas la fonction DEA2, puisque les colonies sont blanches.
Il peut alors s’agir :
– de révertants par suppresseur informationnel de ada1-1, si ce gène est muté par un codon
stop, mais dans ce cas il s’agit d’un stop différent de celui affectant DEA2, sinon le suppresseur
aurait un effet sur celui-ci et la colonie serait rouge;
– de révertants par un suppresseur intragénique de ADA1;
– de révertants par un suppresseur physiologique compensant la perte de fonction soit de
DEA2, soit de ADA1, soit éventuellement des deux fonctions à la fois, ces fonctions étant
de même nature (désaminase);
– de révertants par une mutation affectant un gène de régulation du gène ADA1, si la mutation
ada1-1 ne touche pas en réalité le gène ADA1 (le critère phénotypique d’incapacité de
pousser sur adénine pouvant résulter d’une mutation dans le gène de structure de ADA1 ou
dans un gène de régulation).
