Apport des puces à ADN dans le diagnostic étiologique des pleurésies

 

Introduction :

Le mésothéliome pleural malin (MPM) est une tumeur maligne agressive, dont l’incidence est en constante augmentation . Cette pathologie est de mauvais pronostic, avec un taux de survie à 5 ans inférieur à 5 %. Toutefois, l’utilisation de nouvelles molécules de chimiothérapie, telles que le pemetrexed ou le raltitrexed, en association avec le cisplatine, permet d’allonger significativement la survie des patients. De plus, une prise en charge thérapeutique multimodale, associant chirurgie, chimiothérapie et Apport des puces à ADN dans le diagnostic étiologique des pleurésies étude de faisabilitéradiothérapie, pourrait être bénéfique en terme de survie pour des patients sélectionnés et de stade peu avancé. Ainsi la précocité du diagnostic apparaît aujourd’hui comme l’un des paramètres essentiels du succès thérapeutique dans la prise du MPM. Néanmoins, le diagnostic de MPM reste difficile, et ce pour plusieurs raisons. Tout d’abord, la symptomatologie présentée par les patients est insidieuse et non spécifique. L’imagerie thoracique est peu contributive au diagnostic, en raison des particularités anatomiques de la plèvre. Enfin, si la ponction pleurale a la capacité de faire le diagnostic de pleurésie maligne, elle ne permet que rarement de porter le diagnostic précis de MPM. En effet, l’analyse cytologique du liquide pleural fait difficilement la distinction entre un MPM et un adénocarcinome (ADK) métastatique.

Quant à la biopsie pleurale percutanée, elle ramène le plus souvent peu de matériel tissulaire, lequel est indispensable pour confirmer le diagnostic de MPM. En conséquent le rendement diagnostique de ces techniques est médiocre : environ 24 % pour la biopsie percutanée et 28 % pour la cytologie pleurale. Ainsi, la réalisation d’une thoracoscopie est nécessaire pour porter un diagnostic certain de MPM. Toutefois, en dépit du développement de nouveaux marqueurs immunohistochimiques, tels que les anticorps anti-calrétinine, anti-cytokératine 5/6 et anti-WT1, le diagnostic anatomopathologique de MPM reste délicat en raison du grand pléomorphisme de cette tumeur. Dans un tel contexte, le développement de nouveaux outils diagnostiques pourrait être utile à la prise en charge des patients souffrant d’un épanchement pleural et suspects de MPM.

Les travaux de séquençage du génome humain ont conduit à l’élaboration de la technologie des puces à ADN (DNA microarray en anglais). Celle-ci permet d’envisager une approche globale du processus tumoral par l’analyse comparative des gènes exprimés et du niveau de leur expression. Il s’agit d’une technique à grande échelle, permettant d’étudier simultanément plusieurs milliers de gènes. Les puces à ADN ont ainsi pu démontrer, dans de nombreuses pathologies néoplasiques, leur intérêt diagnostique, pronostique et prédictif de la réponse thérapeutique. Cette technologie a récemment été appliquée à l’étude du MPM. Des auteurs ont tout d’abord comparé le profil d’expression génique de lignées cellulaires de MPM à celui de lignées de cellules mésothéliales normales : ils ont pu montrer que plus de 95 % des gènes étudiés avaient une expression comparable dans les deux types de lignées cellulaires.

En revanche, plusieurs dizaines à plusieurs centaines de gènes différaient significativement dans leur expression : il s’agissait de gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire, dans la prolifération cellulaire, dans la réparation de l’ADN, dans les fonctions d’adhérence et de migration, et dans les capacités d’invasion tissulaire. Ces résultats laissaient présumer, entre autres, d’un intérêt diagnostique à l’utilisation des puces à ADN dans le cadre du MPM.

Toutefois, il n’était pas certain que les résultats obtenus sur des lignées cellulaires en culture soient directement transposables in vivo. Singhal et coll. ont alors comparé des prélèvements humains de MPM à des prélèvements de tissu pleural normal. Sur les 4 132 gènes testés, les auteurs ont retrouvé 166 gènes surexprimés et 26 gènes sous-exprimés dans les prélèvements de MPM. L’équipe de Gordon et coll. a comparé des prélèvements humains de MPM à des prélèvements de métastases pleurales d’ADK. À partir des niveaux d’expression de six gènes, les auteurs ont construit un outil mathématique, permettant de différencier MPM et ADK dans 99 % des cas. Ces résultats, validés récemment sur un échantillon de tumeurs indépendant, suggèrent un intérêt à l’utilisation des puces à ADN pour le diagnostic positif de MPM.

Toutefois, l’obtention de tissu pleural nécessaire pour ces analyses requiert la réalisation d’une thoracoscopie ou d’une thoracotomie. Il s’agit d’interventions invasives, ne pouvant être réalisées chez l’ensemble des patients, ces derniers pouvant être récusés pour des raisons anesthésiques ou fonctionnelles respiratoires. En revanche, la réalisation d’une ponction pleurale à l’aide d’un trocart spécifique ne souffre aucune contre-indication absolue et peut donc être réalisée chez tous les patients porteurs d’un épanchement pleural.

C’est la raison pour laquelle l’objectif de cette étude était d’analyser, à l’aide de puces à ADN, l’expression des gènes au niveau des cellules présentes dans le liquide pleural, ce qui, à notre connaissance, n’avait jamais été entrepris. Après avoir évalué la faisabilité d’une telle approche, nous avons voulu apprécier l’apport potentiel de cette technique dans la prise en charge diagnostique des épanchements pleuraux, en comparant le profil d’expression des gènes selon l’étiologie de la pleurésie.

Matériels et Méthodes :

Schéma de l’étude :

Il s’agit d’une étude prospective sans bénéfice individuel direct. Elle a été conduite dans un centre hospitalouniversitaire. Le protocole de l’étude a reçu l’avis favorable du comité consultatif de protection des personnes dans la recherche biomédicale. Avant de participer à l’étude, chaque patient a reçu une information concernant les principales données du protocole, puis a donné son consentement par écrit.

Patients :

Les patients qui présentaient un épanchement pleural, nécessitant une ponction pleurale à visée diagnostique, étaient éligibles pour participer à l’étude. Les patients antérieurement traités par chimiothérapie anticancéreuse étaient inéligibles. Le diagnostic étiologique de l’épanchement pleural a été retenu sur les données de l’examen cytologique et de l’examen anatomopathologique, ce dernier étant réalisé sur des biopsies pleurales obtenues par thoracoscopie. Pour les épanchements pleuraux non néoplasiques, le diagnostic étiologique a été porté grâce aux examens cardiovasculaires et bactériologiques.

Échantillons de liquide pleural :

Cinquante à cent millilitres de liquide pleural étaient recueillis pour une analyse biochimique, bactériologique et cytologique (complétée si nécessaire par une étude en immunocytochimie). Pour chaque patient, 500 millilitres de liquide pleural supplémentaires étaient recueillis dans le cadre de l’étude. Les prélèvements ainsi obtenus étaient alors transférés au laboratoire de Biologie Cellulaire dans un conditionnement réfrigérant. Dès leur arrivée au laboratoire, la numération en cellules et la formule des éléments nucléés étaient réalisées. Les prélèvements étaient ensuite centrifugés, afin d’obtenir des culots de 107 cellules, puis étaient congelés à -80 °C.

Puces à ADN :

Les informations rapportées dans ce chapitre répondent aux recommandations de la Microarray Gene Expression Data Society.

L’intégralité du schéma expérimental est détaillée dans l’annexe 1. Brièvement, l’ARN contenu dans les cellules présentes dans le liquide pleural était extrait et purifié. Son intégrité était ensuite appréciée à l’aide de « l’Agilent 2100 Bioanalyzer » (Agilent Technologies, USA), mis à disposition par l’IFR 125 IPHM (Faculté de Médecine, Marseille, France), permettant d’analyser l’aspect de l’électrophorégramme, d’apprécier le rapport de l’aire sous le pic de la sousunité 28S sur l’aire sous le pic de la sous-unité 18S (rRNA ratio [28S/18S]) et de calculer le « RNA Integrity Number » (RIN). Seuls les échantillons contenant de l’ARN de bonne qualité (RIN supérieur ou égal à 6) étaient éligibles à la poursuite de l’étude.

L’ARN était ensuite rétrotranscrit en ADN complémentaire, puis ce dernier était transcrit en ARN complémentaire (ARNc) marqué avec un fluorochrome. Les ARNc fluorescents de nos échantillons étaient ensuite hybridés deux à deux sur des puces à ADN de 60 mer (« Whole Human Genome Oligo Microarray Kit », référence G4112A, Agilent Technologies, USA) par le laboratoire Agilent (Waldbronn, Allemagne), permettant d’étudier l’ensemble du génome humain. Afin d’évaluer la reproductibilité de notre approche, des expériences de contrôle ont été réalisées.

Statistiques :

Le traitement statistique des données était réalisé à l’aide de la plate-forme bioinformatique « Rosetta Luminator System », version 3.0 (Rosetta Biosoftware, USA), mise à disposition par l’IFR 125 IPHM (Faculté de Médecine, Marseille, France). Cette plate-forme permettait, entre autres, le calcul du rapport d’intensité entre les deux fluorochromes et donc du rapport de concentration des ARN provenant de deux échantillons différents. Un seuil de 2 a été choisi pour définir une expression différentielle des gènes entre deux échantillons. La plate-forme bioinformatique « Rosetta Luminator System » permettait également d’apprécier statistiquement les différences des rapports d’expression génique à l’aide d’un modèle statistique développé spécifiquement pour la technologie des puces à ADN, permettant d’estimer la valeur de p. Les résultats ont été considérés comme statistiquement significatifs pour des valeurs de p < 0,001. Enfin, La concordance des résultats des expériences de contrôle était évaluée par le calcul du coefficient de corrélation de Pearson.

Résultats :

Patients :

De novembre 2004 à mai 2005, dix-sept patients ont été inclus dans cette étude. Brièvement, la moyenne d’âge des patients était de 66,5 ans. Près de la moitié des patients avait des antécédents de tabagisme et cinq patients avaient été exposés professionnellement à l’amiante. En moyenne, les patients avaient un index de comorbidités de Charlson à 4,65. Il s’agissait dans tous les cas de pleurésies exsudatives. En terme de diagnostic étiologique, quatre patients souffraient de mésothéliome pleural malin, huit patients présentaient une pleurésie métastatique (deux adénocarcinomes mammaires, quatre adénocarcinomes bronchiques, un angiosarcome de la cuisse et un carcinome indifférencié de primitif inconnu) et cinq patients une pleurésie bénigne (deux insuffisances cardiaques, une pleurésie tuberculeuse, une pleurésie parapneumonique et une pleurésie inflammatoire).

Échantillons de liquide pleural :

Les ponctions pleurales ont recueilli au moins 600 ml de liquide pleural pour chacun des patients. Pour les huit premiers patients, le délai moyen entre la ponction pleurale et la congélation des culots cellulaires était de 120 minutes. Pour les neuf patients suivants, ce délai moyen a été ramené à 45 minutes.

Puces à ADN :

Parmi les échantillons de liquide pleural des 17 patients inclus dans l’étude, seuls ceux de quatre patients ont pu offrir de l’ARN répondant aux critères de qualité précédemment fixés. Il s’agissait des patients n° 4, n° 7, n° 10 et n° 15. Le patient n° 4 souffrait d’un mésothéliome pleural malin droit de type épithélioïde, de stade Ib (T1bN0M0). La patiente n° 7 souffrait d’un carcinome indifférencié (CI) métastatique dont le primitif est resté indéterminé. La patiente n° 10 souffrait d’une récidive, sous une forme métastatique, d’un adénocarcinome mammaire de type canalaire infiltrant. Enfin le patient n° 15 présentait un MPM gauche, de type épithélioïde également, de stade III (T2N1M0). Les prélèvements des 13 autres patients contenaient de l’ARN trop dégradé pour être exploitables. Une fois les phases d’amplification et de marquage de l’ARN effectuées, le prélèvement du patient n° 15 a été exclu de la suite de l’étude, en raison d’un défaut d’incorporation des fluorochromes.

La reproductibilité de notre technique a tout d’abord été évaluée au moyen de deux expériences dupliquées. et de 0,987, respectivement (p < 0,01). Un biais de marquage a ensuite été écarté à l’aide de trois expériences en « dye swap ». En effet, les coefficients de corrélation de ces expériences ont été de 0,958, de 0,952 et de 0,898, respectivement (p < 0,01). Enfin, la fiabilité de notre approche a été confirmée en comparant les échantillons à eux-mêmes : plus de 99,99 % des gènes étudiés avaient en effet une expression similaire (p < 0,001).

Les échantillons des trois patients exploitables ont été comparés deux à deux. Tout d’abord, l’expression des gènes a été comparée entre l’échantillon pleural du patient n° 4, souffrant de MPM de type épithélioïde, et celui de la patiente n° 10, atteinte d’un ADK mammaire métastatique.

Sur l’ensemble des gènes testés, 28 299 gènes ont été retrouvés à un niveau d’expression comparable dans les deux échantillons . Cependant, 2 433 gènes étaient surexprimés et 3 076 gènes étaient sous-exprimés chez le patient n° 4 par rapport à la patiente n° 10 (p < 0,001). L’analyse exploratoire des profils d’expression a notamment mis en évidence, parmi les gènes surexprimés, le gène de la calrétinine, le gène de la mésothéline et certains gènes impliqués dans des voies de signalisation, comme ceux de la famille WNT par exemple.

Ensuite, l’expression des gènes a été comparée entre l’échantillon pleural du patient n° 4, souffrant de MPM de type épithélioïde, et celui de la patiente n° 7, souffrant d’un CI métastatique, de primitif inconnu. Sur l’ensemble des gènes testés, 31 756 gènes ont été retrouvés à un niveau d’expression comparable dans les deux échantillons. En revanche, 1 052 gènes sont apparus surexprimés et 1 002 gènes sous-exprimés chez le patient n° 4 par rapport à la patiente n° 7 (p < 0,001).

Enfin, l’expression des gènes a été comparée entre l’échantillon pleural de la patiente n° 10, souffrant d’un ADK mammaire métastatique, et celui de la patiente n° 7, souffrant d’un CI métastatique, de primitif inconnu. Sur l’ensemble des gènes testés, 30 345 gènes ont été retrouvés à un niveau d’expression comparable dans les deux échantillons.

En revanche, 2 489 gènes sont apparus surexprimés et 975 gènes sous-exprimés chez la patiente n° 10 par rapport à la patiente n° 7 (p < 0,001).

Discussion :

Devant une pleurésie exsudative, les cliniciens doivent conduire une stratégie diagnostique invasive, comprenant la réalisation d’une thoracoscopie ou d’une thoracotomie exploratrice, afin d’éliminer un MPM, notamment en cas d’exposition à l’amiante. Malgré l’obtention de larges biopsies pleurales, le diagnostic de MPM reste délicat à retenir pour les anatomopathologistes, en raison notamment du grand pléomorphisme de cette tumeur. Dans ce contexte, l’étude du transcriptome pourrait apporter une aide non négligeable, surtout si elle pouvait être effectuée à partir d’un liquide biologique facilement accessible à des prélèvements. Ainsi, la possibilité d’étudier l’expression des gènes à partir de liquide pleural était une idée particulièrement séduisante.

Nos résultats montrent qu’une telle approche est faisable d’un point de vue expérimental. Nous sommes en effet parvenus, pour certains patients, à extraire l’ARN des cellules présentes dans le liquide pleural et, à l’aide de puces à ADN, nous avons pu décrire des profils d’expression génique différentiels. De plus, cette approche paraît fiable et reproductible, au regard des résultats des expériences de contrôle. Par ailleurs, l’analyse exploratoire des profils d’expression génique était concordante avec les données de la littérature.

En effet, parmi les gènes surexprimés chez le patient souffrant de MPM, ont été retrouvés des gènes dont l’expression est réputée spécifique à cette pathologie, tels que le gène de la calrétinine ou celui de la mésothéline. Des gènes de la famille WNT, fortement impliqués dans l’oncogénèse du MPM, étaient également surexprimés dans les prélèvements du patient atteint de MPM. Il faut néanmoins souligner que les différences d’expression génique observées dans ce type d’approche ne sont pas nécessairement en rapport avec les seules variations génotypiques d’une tumeur par rapport à l’autre. Elles peuvent en effet refléter des variations adaptatives des cellules aux différences existant dans leur environnement, que ces différences soient physiologiques ou pathologiques.

Par ailleurs, nos résultats doivent être pondérés par le faible effectif de patients analysables. Parmi les 17 patients inclus, seuls les prélèvements de trois d’entre eux ont pu être exploités. Les prélèvements des autres patients présentaient une dégradation significative de l’ARN, les rendant incompatibles avec une étude du transcriptome. L’ARN étant extrêmement fragile, il est fort probable que le temps écoulé entre la ponction pleurale, réalisée dans un premier établissement, et la congélation à -80°C des culots cellulaires, dans un second établissement, ait été trop important pour éviter une dégradation de l’ARN.

En effet, cette dégradation débute dans les minutes qui suivent le prélèvement, et se poursuit à une vitesse variable selon le type histologique de la tumeur et la nature du tissu prélevé. Bien que raccourci au maximum dans la deuxième partie de l’étude, le délai moyen entre la ponction pleurale et la congélation des culots cellulaires (45 minutes) était vraisemblablement encore trop long pour permettre une étude du transcriptome sur tous les prélèvements de liquide pleural. De plus, nous ne pouvions dans notre étude utiliser de milieu de préservation tissulaire, tels que le « RNALater » (Qiagen, Valencia, CA). En effet, ce type de milieu a démontré sa capacité à préserver l’intégrité de l’ARN pour des prélèvements tissulaires, mais n’est pas adapté à la conservation d’un volume important de liquide biologique (500 ml de liquide pleural dans notre étude). Ce volume était néanmoins nécessaire à l’obtention d’une quantité d’ARN suffisante pour conduire une étude du transcriptome à partir de liquide pleural.

Afin d’optimiser le rendement de notre technique, il conviendrait de disposer d’une plate-forme biologique à proximité immédiate ou au sein même de notre service d’endoscopies. Cela permettrait notamment de centrifuger immédiatement le liquide pleural ponctionné et de congeler les culots cellulaires dans les meilleurs délais.

Ainsi le risque de dégradation de l’ARN serait réduit au maximum. Par ailleurs, à côté de l’étude du transcriptome, un autre point d’intérêt de cette étude aurait pu être l’analyse de l’expression des protéines présentes dans le liquide pleural. Toutefois, l’étude du protéome ne permet pas de s’affranchir des contraintes techniques relatives à la bonne conservation des prélèvements et impose également un traitement immédiat des échantillons.

En dépit de résultats prometteurs, l’étude du transcriptome à partir de liquide pleural, à des fins diagnostiques, ne peut aujourd’hui être transférée en pratique clinique courante. Il s’agit en effet d’une procédure expérimentale lourde effectuée sur des prélèvements particulièrement fragiles.

Outre la nécessité de disposer d’un plateau technique dédié à ce type d’analyses, il est indispensable de disposer d’une grande proximité géographique entre les services cliniques et le laboratoire. Compte tenu de l’ensemble de ces contraintes, l’étude du transcriptome à partir de liquide pleural reste à ce jour exclusivement du domaine de la recherche.

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